Evo-devo de la somitogénesis en cordados: análisis genómico y funcional en anfioxo
- Autores: Senda Jiménez-Delgado
- Directores de la Tesis: Jordi García Fernández (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2008
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: María Ángeles Ros Lasierra (presid.), Ricard Albalat Rodríguez (secret.), Héctor Escrivá (voc.), José Ramon Bayascas Ramírez (voc.), Miguel Manzanares Fourcade (voc.)
- Materias:
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- Resumen
Esta Tesis consta de varios capítulos: Capítulo 1: los genes bHLH.
La somitogénesis es el proceso mediante el que se forman los somitas, paquetes musculares simétricos situados a cada lado de la notocorda. Los somitas se forman a partir del mesodermo presomítico, de manera sincronizada cada X tiempo (ej. 90 minutos en pollo, 120 minutos en ratón) y en sentido anteroposterior, según se va alargando el embrión por la parte caudal.
Los somitas epiteliales se diferencian a medida que van adquiriendo una posición más anterior en dermamiotomo (que dará tejidos como la piel o el músculo esquelético) y esclerotomo (que dará tejidos como el cartílago o los huesos).
En la somitogénesis intervienen tres vías génicas importantes, por un lado la vía Notch, la vía de Wnt y recientemente se ha visto que la vía FGF está también implicada.
Algunos de los genes que intervienen en la somitogénesis presentan una expresión cíclica y en forma de ola, es decir, se activan en un determinado momento y la zona de expresión va desplazándose hacia la parte rostral hasta que se forma el nuevo somita (ej, hairy2áe pollo), entonces la expresión se apaga.
Uno de los grupos más importantes de genes que intervienen en este proceso tan dinámico son los genes con dominio básico Helix Loop Helix. Se trata de factores de transcripción generalmente de carácter represor. Por lo general están bajo la influencia de la vía de Notch.
En esta tesis se ha trabajado con los siguientes genes bHLH: los genes Hairy, Mesp, Paraxis y Scleraxis.
1) Al empezar esta tesis se habían aislado 6 genes de la familia Hairy en la especie americana de anfioxo B. floridae: AmphiHairyA, AmphiHairyB, AmphiHairyC, AmphiHairyD, AmphiHairyE y AmphiHairyF. Cabe destacar que en vertebrados existe uno (ratón) o dos (pollo) genes de esta familia. Se aislaron 2 genes más pertenecientes a esta familia AmphiHairyG y AmphiHairyH, con lo que en total, son ocho genes Hairy los que encontramos en el anfioxo. Esta duplicación es una prueba de que el genoma del anfioxo, siendo de carácter arquetípico y un buen modelo para el estudio de la evolución de las redes génicas en vertebrados, no se ha quedado congelado a lo largo de los 100 millones de años que ha evolucionado independientemente del resto de cordados (artículo publicado I).
De los ocho genes sólo cuatro muestran expresión: AmphiHairyA, AmphiHairyB, AmphiHairyC y AmphiHairyD. Como la suma de la expresión de estos cuatro genes se corresponde con la expresión del gen único de ratón, se estudiaron las regiones reguladoras de estos 4 genes para determinar si seguían el modelo de la subfuncionalización. El modelo DDC (Duplication-Degeneration-Complementation) explica que un gen puede duplicarse varias veces y las copias, en vez de adquirir nuevas funciones o degenerar, acogen cambios en sus regiones reguladoras perdiendo determinados enhancers, de manera que la suma de las funciones de los nuevos genes es igual a la que ejercía el gen único anteriormente. Encontramos varios enhancers comunes que podrían contener la información del lugar de expresión, pues en algún caso se dan expresiones solapadas (artículo publicado II).
2) El gen Mesp es uno de los genes más importante a nivel de la formación de mesodermo. En vertebrados hay 2, uno más temprano en el desarrollo y otro más tardío. A partir del gen Mesp2 de ratón se consiguió encontrar un pequeño trace in silico, a partir del cual se diseñaron primers para hacer sonda. Se hizo un screening sobre una genoteca de cDNA y se aisló y se clonó el cDNA entero del gen Mesp único en anfioxo.
Se han realizado una serie de hibridaciones in situ que aún queda por estudiar para poder publicar en breve (artículo por publicar I).
Además se ha buscado el DNA genómico de este gen en la especie europea de anfioxo, B. lanceolatum.
3) En cuanto a paraxis y scleraxis se un gen único, parascleraxis, del estudio filogenético del cual se desprende que corresponde al gen único y ancestral que posteriormente, debido a las dos rondas de duplicación genómica que se dieron en el origen de los vertebrados, se consolidaron en los dos genes bHLH existentes en vertebrados.
A partir de los pequeños traces con los que se encontró parascleraxis se aisló un gen muy parecido en su dominio a éste, aunque mucho más largo de lo que generalmente son los genes bHLH. Del análisis filogenético exhaustivo vimos que este gen esta altamente relacionado con Mesp, con lo que lo denominamos Mesp-like.
Además, del análisis filogenético encontramos por primera vez una relación muy fuerte entre los genes Mesp y paraxis-scleraxis, nunca antes descrita en la bibliografía existente sobre estos genes.
Actualmente se están terminando las hibridaciones in situ de éstos genes para su inmediata publicación (artículo por publicar I).
Capítulo 2: Los genes Mox Los genes Mox son genes con homeobox. En vertebrados hay dos miembros de esta familia, Mox1 y Mox2. Los knock-outs de estos genes por separado no tienen un fenotipo muy acentuado, pero el fenotipo del knock-out de los dos genes juntos es muy extremo: la somitogénesis no se realiza correctamente y no se forman bien las vértebras ni los demás tejidos que derivan de los somitas.
Anteriormente a esta tesis se había aislado el gen Mox único en anfioxo, el cual tiene expresión en los somitas, dejando patente que la somitogénesis, simétrica en los vertebrados, es asimétrica en anfioxo.
Nosotros aislamos a partir de una genoteca de fagos los DNAs genómicos correspondientes a este gen, para las dos especies de anfioxo con las que estamos trabajando actualmente, la americana (B. floridae) y la europea (B. lanceolatum). Secuenciamos 3kb de la región reguladora y realizamos un estudio comparativo mediante programas on line, entre las dos especies de anfioxo y vertebrados. No se hallaron cajas conservadas entre vertebrados, pero sorprendentemente entre anfioxos, diferenciamos 3 cajas diferenciadas en la zona a 5' y 5 dentro del intrón. Sorprendente porque en otros estudios comparando regiones reguladoras de las dos especies de anfioxo no se distinguen cajas, son prácticamente idénticas.
Se diseñaron morfolinos (pequeños oligo-nucleótidos que silencian la traducción de un gen) para silenciar la traducción del gen mox de la especie europea de anfioxo. Éste es el primer caso en el que se inyecta morfolinos en esta especie con resultados positivos, pues además de inyectar este tipo de moléculas, se ha puesto a punto la técnica de inyección en oocitos de anfioxo, que hasta el momento sólo se había realizado en la especie americana. La especie europea posee unos oocitos más sensibles, con lo que el trabajo de punta a puesta de la técnica ha sido un proceso difícil. El silenciamiento de este gen nos dio un fenotipo extremo, en el que se observa la pérdida de estructuras axiales total, con embriones que presentan solo la parte anterior y posterior, sin tronco (artículo por publicar II).
Además, se clonó el cDNA de amphimox en un vector de expresión, que posteriormente se inyectó en embriones de pollo, en mesodermo y tubo neural. De este estudio se desprende que la activación génica a través de los genes mox depende de las proteínas con las que forman heterodímeros, proteínas de la familia pax, pues al sobreexpresar tanto Mox1 como Mox2 del propio pollo no se obtenían diferencias ni en los marcadores de esclerotomo ni en los marcadores de dermamiotomo. En inyectar amphimox en mesodermo pre-somítico la expresión del gen diana de Mox1, Nkx3.2, se ve claramente afectada, de manera que queda patente que amphimox compite con Mox1, no se sabe si secuestrando a su pareja, pax1, o ligándose al enhancer de manera que impide la unión del heterodímero de manera normal, con lo que no puede transcribirse Nkx3.2 (artículo por publicar II).
Capítulo 3: Análisis del genoma.
Durante el desarrollo de esta tesis el genoma de la especie americana de anfioxo ha sido secuenciado. Un objetivo común a nuestro grupo ha sido la anotación y caracterización de la gran superfamilia de proteínas Tyrosina Kinasa, mediante un método novedoso diseñado por uno de los miembros de nuestro grupo. Como esperábamos, encontramos todas las familias presentes en humano, generalmente con un representante para cada familia. Esto es una prueba más de que el genoma de anfioxo es un referente para realizar estudios evolutivos, pues mantiene un carácter ancestral, sin haber sufrido pérdida de genes como el caso de los tunicados. Nuestros análisis y especialmente el uso del intron code permitieron plantear nuevos escenarios evolutivos para algunas familias (por ejemplo, PDGFR/VEGFR, MET i AXL). Además, encontramos que un grupo de familias muy parecidas entre sí (TIE, FGFR, PDGFR y RET) han sufrido una enorme expansión en el genoma de anfioxo. Proponemos que estas familias tienen un origen común (pues su código intrónico es muy parecido) y que se han formado a lo largo de la evolución a partir de nuevas combinaciones de exones, exon shuffling. Todas ellas las agrupamos en una superfamilia a la que denominamos EXTK (del inglés Expanded Tyrosine Kinase). Relacionadas con ellas hay otras familias como NOK, MET o AXL, también presentan varias duplicaciones en el genoma, no sólo en anfioxo sino también en otros organismos, por lo que proponemos que estas superfamilias, por motivos desconocidos, tienen mayor tendencia a la dupliación, al exon shuffling, y generación de nuevas genes con combinatorias de dominios diferentes. En conclusión, y como se ha apuntado en otros casos anteriormente, el genoma del anfioxo ha seguido evolucionando y presenta sorpresas, como es esta masiva expansión de genes de tyr kinasas (artículo publicado III).
Capítulo 4: desarrollo del modelo.
Finalmente, durante el desarrollo de esta tesis se ha contribuido activamente a la optimización del mantenimiento en cautividad en laboratorios secos de este organismo. Además, se ha conseguido por vez primera un cambio de ciclo de día-noche de este animal para facilitar el trabajo con este organismo, debido a que su reproducción es nocturna.
