Resumen de Clonatge i análisi transcripcional del promotor del gen sp1
El factor de transcripción Sp1 se caracteriza por su unión a las cajas GC de regiones promotoras de gran variedad de genes. El interés de este trabajo se ha centrado en el estudio de la regulación del gen Sp1. Adicionalmente, relacionado con Sp1 y debido a que Sp1 es el principal regulador del gen dihidrofolato reductasa (dhfr) y que este enzima, la dhfr es la diana del agente quimioterápico metotrexato (MTX), en este trabajo también hemos establecido una relación entre Sp1 y el incremento de la resistencia aparecida después del tratamiento con MTX mediada por TPA.
En relación a la primera parte, hemos clonado un fragmento de 1593 pb de la región 5' del gen Sp1. El inició de transcripción lo hemos situado a -63 nt relativos al inicio de la traducción. En esta secuencia promotora hemos identificado posibles sitios de unión para los factores de transcripción: P53, E2F, SP1, C/EBP, NF-Y, CREB, AP2 y AP1. Mediante delecciones de este fragmento hemos identificado la región mínima promotora del gen en los 217 nt upstream del inició de transcripción, dentro de esta secuencia había sitios potenciales de unión para: NF-Y, C/EBP, AP2, SP1UPSTREAM, SP1DOWNSTREAM Y E2F.
Mediante ensayos de retardación de la movilidad electroforética hemos demostrado la unión de los factores Sp1, Sp3 y NF-Y en esta región mínima promotora del gen Sp1.
Para examinar el papel de Sp1 en su regulación, hemos sobrexpresado Sp1, juntamente con un plásmido reprotero a base de luciferasa controlado por la secuencia mínima promotora de Sp1. La sobrexpresión de Sp1 activa la propia actividad transcripcional. Al sobrexpresar Sp3 no hemos observado una diferencia significativa, pero al sobrexpresar Sp3 junto con Sp1 hemos determinado que la activación provodada por Sp1 quedaba contrarrestada al sobrexpresar Sp3. La sobrexpresión de los factores de transcripción NF-Y y E2F también son capaces de activar la transcripción del gen Sp1.
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