Mapeo por secuenciación de alto rendimiento y descubrimiento de spns en melocotonero
- Autores: Claudio Antonio Meneses Araya
- Directores de la Tesis: Werner Howad (codir. tes.), Pere Arús Gorina (codir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Lleida ( España ) en 2011
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Jordi Voltas Velasco (presid.), Antonio Michelena Bárcena (secret.), Antonio Barbadilla Prados (voc.), Ernesto Igartua Arregui (voc.), Amparo Monfort (voc.)
- Materias:
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- Resumen
El melocotonero (Prunus persica (L.) Batsch) es el segundo frutal de clima templado en importancia económica después del manzano y ha sido utilizado como una especie modelo para estudios genéticos y genómicos dentro de su género. Por otra parte, en los últimos años se ha producido una verdadera revolución tecnológica a partir del desarrollo de la secuenciación de alto rendimiento (NGS; "Next Generation Sequencing"), permitiendo rediseñar las estrategias para el descubrimiento de marcadores moleculares y la construcción de mapas genéticos. El objetivo del presente trabajo fue desarrollar estrategias para el descubrimiento de SNPs ("Single Nucleotide Polymorphism") y la construcción de mapas genéticos en melocotonero, transferibles a especies cercanas que no cuentan con recursos genómicos importantes, utilizando las nuevas herramientas disponibles.
Para esto, se desarrolló el programa Bin Mapping de SNPs/indels para la selección, genotipado y ¿bin mapping¿ a partir de datos NGS, el cual permite al usuario, configurar una serie de parámetros para definir un genotipo (homocigoto o heterocigoto) en función de la redundancia de lecturas y mapear SNPs o indels con información incompleta o inexistente para uno o más individuos del "bin set". Para la saturación del mapa de T x E, se obtuvieron 3.340 contigs a partir del ensamblaje de lecturas provenientes de una carrera de secuenciación 454 GS-FLX de ocho genotecas de fragmentos de RAFs ("Random Amplified DNA Fingerprinting"). Se seleccionaron 5.712 indels y 6.678 SNPs contenidos en 2.155 contigs de RAFs determinando una frecuencia de 1 SNP/170 pb. Utilizando el programa Bin Mapping de SNPs/indels se mapearon 984 contigs polimórficos y con marcadores dominantes descubiertos como un subproducto del ensamblaje (presencia o ausencia de lecturas) se mapearon 143 contigs adicionales, obteniendo un total de 1.127 contigs de RAFs mapeados en el mapa de referencia de Prunus. A partir de la comparación de la posición genética y física, 563 contigs (75,4%) fueron coincidentes. Restricciones a la MAF ("Minor Allele Frequency") y el genotipo de los parentales para la selección de un SNPs/indels, mejoraron la fiabilidad de mapeo pero redujeron el rendimiento de los contigs mapeados. La aplicación de la estrategia de "bin mapping" requiere de un mapa saturado preexistente, generalmente no disponible en especies no-modelos. Por esto, se desarrollaron simulaciones informáticas utilizando dos programas generados en este trabajo (PopSim y BinSim) para estimar el número mínimo de individuos seleccionados al azar desde una población de mapeo que permitan la construcción de un mapa de novo, considerando el número de bins totales y el número de bins duplicados inter-grupo de ligamiento en distintos tipos de poblaciones. Se estimaron en 16 y 20 individuos para poblaciones F2 y BC1, respectivamente, como el número mínimo para construir un mapa de novo para distintos niveles de recombinación y número de grupos de ligamiento. A partir del ensamblaje de ESTs in silico de melocotonero obtenidos desde NCBI, se seleccionaron 348 (11,3%) de los contigs polimórficos. Se detectaron 45 SNPs (93,8%) in silico en un subset de validación de 48 SNPs en un panel de ocho variedades de melocotonero, lo que permite considerar esta estrategia eficiente para la obtención de un set de SNPs a partir de información in silico.
La combinación de secuenciación masiva, bioinformática y genética ("bin mapping") permite desarrollar estrategias eficientes para la obtención de SNPs e indels y para la construcción de mapas probadas en melocotonero y transferibles a especies cercanas que cuentan con recursos genómicos insuficientes para apoyar con éxito el desarrollo de herramientas de selección asistida.
Palabras claves: "bin mapping", NGS ("Next Generation Sequencing"), ESTs ("Expressed Sequence Tags") in silico, RAF ("Randomly Amplified DNA Fingerprinting").
