Análisis genético y funcional de genes específicos para producción de mangotoxina

• Autores: Victor José Carrión Bravo
• Directores de la Tesis: Antonio de Vicente Moreno (dir. tes.), Eva Arrebola (codir. tes.), Francisco Manuel Cazorla López (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Málaga ( España ) en 2012
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Jesús Murillo Martínez (presid.), Cayo Ramos Rodríguez (secret.), Jos M. Raaijmakers (voc.), Rafael Rivilla Palma (voc.), Robert W. Jackson (voc.)
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Antimetabolitos
  • Ciencias de la vida
    • Microbiología
      • Bacteriología
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• Resumen

  • Pseudomonas syringae es una bacteria fitopatógena capaz de producir diferentes factores de virulencia, entre los que podemos destacar las fitotoxinas. Esta tesis doctoral se centra en el estudio de una toxina antimetabolito descrita por nuestro grupo de investigación y a la cual denominamos mangotoxina. Dicha toxina es producida principalmente por cepas de P. syringae pv. syringae, aisladas de mango. Estudios previos han mostrado que la mangotoxina es un pequeño oligopéptido que inhibe a la enzima ornitina N-acetil transferasa, paso clave en la ruta de biosíntesis de ornitina y arginina. En trabajos anteriores, se realizó una mutagénesis al azar usando transposones miniTn5, obteniéndose una serie de mutantes defectivos en la producción de mangotoxina. El análisis de los genes interrumpidos puso de manifiesto la participación de un grupo de genes, posteriormente denominado operón mgo y que incluye entre otros genes, el gen mgoA que codifica una posible NRPS. El operón mgo, y concretamente el gen mgoA, participan en la producción de mangotoxina y contribuyen a la virulencia de las cepas productoras, tal y como ya ha sido descrito por nuestro grupo. En el capítulo 1 se presenta un resumen sobre la enfermedad causada por P. syringae pv. syringae en las plantaciones de mango (mangifera indica L.). En este apartado se revisa la filogenia, biología y los principales factores de virulencia producidos por el genero Pseudomonas. En el capítulo 2 se describe detalladamente la identificación y el análisis de genes implicados en la biosíntesis de mangotoxina en nuestra cepa modelo UMAF0158. Se detectó una región cromosómica no está presente en cepas de P. syringae secuenciadas y caracterizadas como no productoras de mangotixina. Mediante un análisis más detallado de estos seis genes, se determinó que presentaban una organización en forma de operón. La organización en operón fue comprobada usando técnicas moleculares, mostrándose la presencia de una única unidad transcripcional. Este operón se denominó ¿mbo¿ procedente de las siglas de mangotoxin biosynthetic operon. En el capítulo 3 se ha desarrollado un sistema de detección del operón mbo basado en técnicas moleculares de PCR, el cual se ha contrastado con el análisis fenotípico de la producción de mangotoxina en un grupo de 93 cepas pertenecientes a P. syringae. Los dejadores seleccionados amplificaban 692 pb del operón mbo en las cepas productoras de mangotoxina. Esta técnica nos ha permitido desarrollar un método fácil y rápido de detección del operón mbo. Por otro lado, en este trabajo se han realizado análisis filogenéticos basados en las secuencias de genes housekeeping, para intentar resolver la historia evolutiva del operón mbo y precisar la relación filogenética entre las cepas usadas en este estudio. El principal objetivo del capítulo 4 de esta tesis, ha sido realizar un estudio de la regulación de la producción de mangotoxina. Para poder estudiar la regulación de la producción de mangotoxina, se llevó a cabo un análisis transcripcional de la cepa silvestre y de los mutantes en gacA y mgoA, mediante PCR cuantitativa en tiempo real. En el capítulo 5 se ha realizado una discusión general de los resultados obtenidos en esta tesis y finalmente, se muestran las principales conclusiones que se derivan de los resultados expuestos en esta memoria.