Desarrollo de métodos rápidos para el análisis de listeria monocytogenes y su aplicación al proceso de evaluación del riesgo en la industria cárnica

• Autores: Mirian Labrador Bernad
• Directores de la Tesis: Carmen Rota Garcia (dir. tes.), Susana Bayarri (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Zaragoza ( España ) en 2018
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Domingo Blanco Parmo (presid.), Rafael Jordano Salinas (secret.), Maria Teresa Mora Ventura (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Calidad, Seguridad y Tecnología de los Alimentos por la Universidad de Zaragoza
• Materias:
  • Ciencias médicas
    • Ciencias de la nutrición
      • Agentes patógenos de los alimentos
  • Ciencias tecnológicas
    • Tecnología de los alimentos
      • Higiene de los alimentos
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Zaguán
• Resumen

  • La industria cárnica se enfrenta al reto de ofrecer productos de calidad, económicamente competitivos y que cumplan con estrictos criterios de seguridad alimentaria. L. monocytogenes es el agente causal de la listeriosis, una enfermedad grave producida por el consumo de alimentos contaminados, principalmente alimentos listos para el consumo (LPC), y que presenta una elevada letalidad en determinados grupos de riesgo. Esta bacteria es ubiquitaria y sobrevive en condiciones ambientales adversas, por lo que se encuentra de forma habitual en los entornos de procesado de alimentos, suponiendo un riesgo de contaminación cruzada con los mismos. Debido a los datos de letalidad, países como Estados Unidos aplican la política de la “tolerancia cero” (i.e. ausencia en 25 g) en relación a la presencia de este patógeno en productos LPC, incluso para aquellos que no favorecen el crecimiento del patógeno, como el jamón curado.

    España es un país con una tradición muy rica en la elaboración y consumo de embutidos curados y jamones. De los diferentes productos cárnicos derivados de cerdo, el jamón curado destaca por ser un producto de alta calidad muy apreciado por los consumidores. En la actualidad, este sector está experimentando un fenómeno de internacionalización, con gran aceptación entre los consumidores de otros países.

    El Reglamento (CE) Nº 2073/2005 y sus posteriores modificaciones establece criterios microbiológicos de seguridad alimentaria relativos a L. monocytogenes en alimentos LPC (ausencia en 25 g y 100 ufc/g) dependiendo de si pueden favorecer o no el desarrollo del patógeno. Además, en industrias productoras de este tipo de alimentos exige realizar un control de superficies. Los métodos de referencia para la detección (ISO 11290-1:2017) y cuantificación (ISO 11290-2:2017) de este microorganismo son largos y costosos. Por ello, las industrias demandan metodologías alternativas fiables, rápidas y que permitan el análisis de un elevado número de muestras para mejorar el control del patógeno y posibilitar la toma de decisiones de una manera más rápida y eficaz, evitando así la llegada de alimentos contaminados a los consumidores.

    Por otro lado, la caracterización genotípica de los aislados de L. monocytogenes procedentes del proceso de elaboración del jamón curado aporta información de gran importancia tanto para las autoridades sanitarias como para la industria. Gracias a ella pueden determinarse rutas y nichos de contaminación, así como detectar la presencia de cepas del patógeno esporádicas y persistentes. Con toda esta información pueden tomarse medidas correctoras y/o de control cuyo objetivo es lograr la eliminación eficaz del patógeno de la industria. Por ello, los objetivos de esta Tesis Doctoral han sido la puesta a punto y evaluación de métodos alternativos rápidos para la detección y cuantificación de L. monocytogenes en jamón curado loncheado y envasado al vacío, así como la detección del patógeno en el proceso de elaboración de este producto cárnico y posterior caracterización genotípica de los aislados obtenidos, para así poder contribuir al proceso de evaluación del riesgo y aportar medidas de control de L. monocytogenes a la industria cárnica.

    Se ha realizado la puesta a punto y evaluación de la impedanciometría combinada con agar cromogénico OCLA (Oxoid Chromogenic Listeria Agar) en comparación con el método de referencia para la detección de L. monocytogenes en jamón curado. Este estudio se ha desarrollado en base a parámetros reconocidos internacionalmente, establecidos en la norma ISO 16140-2:2016 entre otros. En la evaluación de la metodología alternativa en matriz se han obtenido resultados muy satisfactorios ya que se observó una concordancia excelente entre los resultados obtenidos por el método alternativo y de referencia, no apareciendo falsos positivos y negativos, siendo capaz de detectar 1 ufc/25 g de alimento. Este método permite obtener un resultado positivo confirmado en 4-5 días, y resultados negativos a Listeria spp. en menos de tres días, lo que supone un ahorro considerable de tiempo con respecto al método de referencia. Además, es sencillo y permite el análisis simultáneo de 21 muestras, facilitando el flujo de trabajo en el laboratorio.

    Asimismo, se ha evaluado la impedanciometría incluyendo mejoras del mercado orientadas a reducir el tiempo de análisis, simplificar la metodología y análisis de un mayor número de muestras de forma simultánea. Estas mejoras han consistido en el ensayo de un medio de cultivo diferente (One Broth Listeria), un equipo de mayores prestaciones (BacTrac 4300) y distintos sistemas de identificación del patógeno: agar cromogénico Rapid L. mono y un kit de hibridación de RNA (RiboFlow Listeria Twin). Además, se ha evaluado otra metodología alternativa como es la PCR a tiempo real (iQ-Check® Listeria monocytogenes II Kit) para la detección del patógeno en jamón curado.

    El estudio de la exclusividad e inclusividad de los métodos alternativos ha dado muy buenos resultados ya que no se han mostrado interferencias en la detección del patógeno. Además, los métodos alternativos han sido capaces de detectar concentraciones muy bajas de L. monocytogenes (<1 ufc/25 g). La impedanciometría combinada con Rapid L. mono asi como la PCR a tiempo real han presentado una concordancia excelente con el método de referencia, no observándose falsos positivos ni negativos, por lo que se han considerado métodos fiables. Sin embargo, esta concordancia fue menor en la impedanciometría combinada con RiboFlow Listeria Twin ya que aparecieron falsos positivos y negativos, afectando negativamente a la sensibilidad, veracidad y especificidad de la metodología.

    La impedanciometría combinada con Rapid L. mono necesitó de 2,5 a 4 días para obtener un resultado positivo confirmado a L. monocytogenes y 48 h para un resultado negativo a Listeria spp. La PCR a tiempo real ofreció un resultado positivo confirmado en 48 h y negativo en 24 h. Sin embargo, debido a su fiabilidad, sencillez y a que es más económica en relación a la PCR a tiempo real, se seleccionó la impedanciometría combinada con Rapid L. mono para el análisis de L. monocytogenes en el proceso de elaboración del jamón curado loncheado y envasado al vacío.

    Asimismo, y debido a la importancia de cuantificar los resultados de una detección positiva en base al cumplimiento de los criterios microbiológicos, se ha evaluado un método qPCR para la cuantificación de L. monocytogenes en jamón curado. Para ello, se ha optimizado la reacción PCR, así como las curvas estándar de DNA, celular (cultivo puro) y en jamón curado de L. monocytogenes. Al igual que para las metodologías anteriores, el método qPCR se ha evaluado conforme a parámetros internacionalmente reconocidos. Este método permite la detección y cuantificación de muy bajas concentraciones del microorganismo (30,16,2 ufc/g), con una elevada precisión, cumpliendo con los parámetros de aceptación. La concordancia de los resultados obtenidos por el método qPCR y el de referencia fue excelente por lo que este método alternativo es fiable, rápido y facilita el trabajo en el laboratorio permitiendo el análisis de un número elevado de muestras simultáneamente.

    Finalmente, se ha realizado un estudio de la contaminación por L. monocytogenes en la industria de elaboración del jamón curado. Así, se han analizado 120 muestras de este producto loncheado y envasado al vacío y 281 muestras de superficies relacionadas con el proceso de elaboración de este producto cárnico y procedentes de una misma industria. Las muestras de superficies se han tomado en diferentes días a lo largo de seis meses en dos zonas del procesado: 1) deshuesado y 2) loncheado y envasado a vacío. Las muestras procedieron de las superficies antes (limpias) y después (sucias) de la jornada de trabajo. Se muestrearon diferentes tipos de equipos, cintas transportadoras y accesorios. La identificación de otras especies no patógenas de Listeria se ha llevado a cabo mediante MALDI-TOF MS. La determinación del serotipo molecular y la subtipificación de los aislados de L. monocytogenes se ha realizado mediante PCR multiplex y electroforesis en gel en campo pulsante (PFGE), respectivamente.

    Se ha detectado la presencia de otras especies apatógenas de Listeria en el 10,8 % y en el 33,4 % de las muestras de jamón curado y de superficies, respectivamente. L. monocytogenes ha sido detectada en cuatro muestras de 25 g de jamón curado (3,3 %) y en 26 muestras de superficies (9,3 %). Concretamente, se ha observado la presencia de la bacteria en cintas transportadoras (n=15), desgubiadora (n=5), mesas (n=3), moldeadora (n=2) y deshuesadoras (n=1). La zona de deshuesado se ha presentado como la de mayor riesgo de contaminación con el patógeno. Sin embargo, la probabilidad de encontrar la presencia de L. monocytogenes ha sido la misma independientemente del estado de las superficies (limpia o sucia) (p 0,05). Las superficies limpias de la zona de deshuesado han presentado mayor riesgo de estar contaminadas con L. monocytogenes, que las homólogas de la zona de loncheado y envasado (p <0,05). Se ha observado que las cintas articuladas y las desgubiadoras fueron las superficies de mayor riesgo de contaminación con L. monocytogenes. En este estudio, se ha observado que en el alimento no ha habido coexistencia de L. monocytogenes con otras especies de su genero, al contrario de lo observado en las superficies.

    El serotipo molecular predominante de los 25 aislados analizados ha sido el 1/2a (84 %), seguido por el 1/2b (8 %) y 1/2c (8 %). Esta predominancia del serotipo molecular 1/2a se observó tanto en los aislados procedentes de jamón curado como de las superficies.

    Se han obtenido seis pulsotipos diferentes: S1, S2-1, S2-2, S3, S4 y S5. Los seis pulsotipos aparecieron en diferentes superficies de la zona de deshuesado. Sin embargo, en la zona de loncheado únicamente se aisló el pulsotipo S2-1. Todos los pulsotipos procedentes del jamón curado fueron aislados de las superficies en algún momento del estudio, mostrando la elevada importancia del ambiente de procesado como fuente de contaminación de los alimentos. El pulsotipo S2-1 mostró un carácter persistente y predominante a lo largo del estudio.

    De los resultados obtenidos, la propuesta de medidas de control va dirigida a optimizar el protocolo de limpieza y desinfección en la zona de deshuesado y mejorar el diseño higiénico de determinados tipos de superficies como las cintas transportadoras y la desgubiadora, así como de las instalaciones.