New in silico strategies for the prediction of microrna targets: understanding another level of regulation of the gene xbp1
- Autores: Dannys Jorge Martínez Herrera
- Directores de la Tesis: Alberto Pascual Montano (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2017
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: José María Carazo García (presid.), Ana Dopazo González (secret.), Victoriano Segura Ruiz (voc.), Rubén Nogales Cadenas (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biociencias Moleculares por la Universidad Autónoma de Madrid
- Materias:
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- Resumen
- español
RESUMEN Los microRNAs (miRNAs) son moléculas de RNA de aproximadamente 22 nucleótidos (nt) que se unen a una proteína de la familia Argonaute (Ago) y regulan posttranscripcionalmente la expresión de los RNA mensajeros (RNAm). Los miRNAs tienen un papel importante en procesos patológicos y fisiológicos, incluyendo algunas funciones específicas del Retículo Endoplásmico (RE). El proceso conocido como Unfolded Protein Response (UPR) es una vía de transducción iniciada en el RE, para revertir el estado de estrés producido por acumulación de proteínas mal plegadas en su interior.
XBP1 es un factor de transcripción con un papel central en la UPR. Su transcrito sufre un proceso de splicing citosólico que libera un intrón de 26nt. El intrón del gen homólogo de XBP1 en levaduras, HAC1, se une a la región 5’UTR del transcrito evitando su expresión. Este y otros hallazgos recientes, como la presencia de lecturas de secuenciación de RNAs unidos a Ago, que alinean sobre la región del intrón de XBP1, nos condujeron a la hipótesis de que el intrón de XBP1 podría regular la expresión de su gen hospedero actuando como un miRNA.
A pesar del desarrollo de técnicas basadas en la ultrasecuenciación de RNAs unidos a proteínas, aún son necesarios los métodos de predicción para determinar el sitio exacto de la unión. Sin embargo, ningún método parece ser claramente superior al resto. En este trabajo hemos desarrollado tres algoritmos para la predicción de sitios de unión de miRNAs. Dos de ellos fueron evaluados utilizando interacciones miRNA-diana identificadas experimentalmente, exhibiendo una tasa de falsos positivos menor que la de cinco de los algoritmos más utilizados. Además, uno de nuestros métodos tiene un rendimiento global superior al de estos algoritmos.
Utilizando este método, se predijo un posible sitio de unión para el intrón de XBP1 en la región 3’UTR del transcrito spliceado, que fue estudiado mediante un análisis mutacional. Nuestros resultados describen un modelo en el que el intrón, una vez eliminado del RNAm de XBP1 tras la reacción de splicing, contribuye a la apertura de una estructura de doble cadena en el RNAm de XBP1, que reduce su expresión en un 60%. Además, la inserción de una secuencia aptámero en el intrón, nos permitió describir por primera vez una molécula intrónica que es circularizada in vivo en condiciones de estrés de RE.
- English
ABSTRACT MicroRNAs (miRNAs) are endogenous, ~22 nucleotide (nt) RNA molecules that regulate gene expression posttranscriptionally, once bound to one member of the Argonaute (Ago) family of proteins. By targeting messenger RNAs, miRNAs have a major impact on many pathological and physiological processes, including the regulation of endoplasmic reticulum (ER)-specific functions. The Unfolded Protein Response (UPR) is an ER-to-nucleus transduction pathway activated to cope with the toxicity of the ER stress, caused by the accumulation of misfolded proteins. XBP1s is a transcription factor that plays a key role in the UPR. Its mRNA undergoes a rare cytoplasmic splicing that releases a 26nt intron. In yeast, the intron of the XBP1 homolog, HAC1, binds to the 5’UTR of the gene and represses its expression prior to the splicing reaction. This and other recent findings, such as the presence of Ago-bound RNA sequencing reads mapping to the region of XBP1 intron, point toward the idea of this intron acting as a miRNA to regulate its own gene expression.
In spite of the development of techniques based on RNA-protein crosslinking followed by RNA deep-sequencing, prediction algorithms must be used to point the exact binding site and its configuration. However, there is not yet a method clearly performing better than the rest. Here we developed three methods for the prediction of miRNA binding sites. Their evaluation, using experimentally determined miRNA-target interactions, demonstrates that most of these algorithms exhibit lower true positive rates than five of the most established algorithms, and one of the methods designed in this work outperforms all of them at the score threshold of best performance.
Using our best performing method, we predicted a binding site for the intron of XBP1 on the 3’UTR of its spliced transcript. We also conducted a mutational analysis to experimentally determine whether XBP1 intron could target a putative site in its host gene mRNA. Our results are consistent with a model whereby XBP1 intron, after being excised by UPR splicing contributes to release an intramolecular double-stranded structure that blocks the expression of XBP1 in 60%. Also, by using an aptamer-tagged XBP1 intron variant, we report for the first time the circularization of an intronic molecule under ER stress induction in vivo.
- español
