Resumen de Incidencia, caracterización y control de cucumber green mottle mosaic virus en el sudente de españa
El virus del mosaico verde jaspeado del pepino (Cucumber green mottle mosaic virus; CGMMV) representa actualmente una gran amenaza a nivel mundial para los cultivos de cucurbitáceas. Solamente en el sureste de España se producen anualmente más de 700.000 toneladas de pepinos (Cucumis sativus L.) y 400.000 de calabacines (Cucurbita pepo L.), por lo que el conocimiento de su diversidad biológica, molecular y epidemiología se hace crucial para poder entender y controlar la enfermedad. En España, desde su descripción en 1os años 90 se han ido dando numerosos brotes nuevos hasta la actualidad afectando principalmente al pepino, pero también a sandía. Sin embargo, la biología del virus ha sido poco estudiado en España donde sólo se ha descrito hasta el momento la secuencia parcial de los genes para la proteína de la cápside (CP) y proteína de movimiento (MP) asi como la secuencia genómica completa de una nueva cepa aislada en Almería (Alm08) denominada CGMMV-SP y no ha habido estudios biológicos comparativos del mismo. Por este motivo, se ha analizado dicha secuencia genómica completa estudiando sus relaciones filogenéticas, así como su rango de hospedadores. Además, se obtuvieron las secuencias parciales de los genes que codifican para la replicasa (RdRp) y MP, y las completas para la CP de 26 aislados recogidos bajo invernadero de cultivos de melón, sandía y pepino de la zona del sureste español durante los años 2013, 2014 y 2015. Quince aislados representativos de cepas con origen asiático o europeo fueron seleccionados para su caracterización biológica. El análisis filogenético determinó que los aislados se separan en dos grupos: un primer grupo (I) formado por aislados recogidos durante 2013 y 2014 en el que se incluyen aislados de referencia de Francia, Holanda y Uzbekistán, y un segundo grupo (II) constituido por aislados recogidos mayoritariamente en 2015 y del que forman parte también aislados de Japón, Corea del Sur y Canadá. Además, determinamos por primera vez la coexistencia en España de aislados de CGMMV con diferente origen geográfico (asiático o europeo) en un mismo cultivo y región, estableciendo que su diferencia a nivel biológico respecto a los hospedadores analizados radica en la aparición de lesiones locales en forma de moteado clorótico en Chenopodium album ssp. amaranticolor tras la inoculación mecánica de un número representativo de aislados pertenecientes al grupo II; lesiones que no aparecieron en el caso de los aislados inoculados pertenecientes al grupo I. Finalmente, desarrollamos un método que permitió distinguir entre aislados del grupo I y II mediante el análisis del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) realizado con la enzima de restricción KpnI tras digerir los productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) resultantes de la amplificación de la secuencia del gen que codifica para la CP.
Además, se han analizado distintas fuentes de resistencia, tanto frente a la cepa de origen europeo (CGMMV-SP) como a la de origen asiático (CG-SpCu16) en 58 accesiones de pepino, entre los que se encuentran Cucumis sativus var. hardwickii y C. sativus var. sikkimensis. Además, se incluyeron C. anguria L. (pepinillo erizo) y C. metuliferus E. Mey (pepino africano). En todas ellas se realizó una gradación de la sintomatología observada y se analizó la carga viral a lo largo del periodo del cultivo mediante reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real con retrotranscripción (quantitative reverse transcription PCR o RT-qPCR) en un número de accesiones seleccionadas que abarcan todos los tipos de sintomatología observada. Obtuvimos dos accesiones de pepino que mostraron síntomas suaves durante todo el periodo de cultivo. C. anguria L. no mostró síntomas y la detección del virus mediante RT-PCR convencional fue negativa. El resto de las 44 accesiones de pepino, incluyendo C. sativus var. hardwickii, mostraron síntomas severos típicos de la enfermedad. Otras 10 accesiones de pepino, incluyendo C. sativus var. sikkimensis, desarrollaron síntomas que clasificamos como intermedios. Todas las accesiones con carga viral alta correspondieron con las 44 accesiones que desarrollaron síntomas severos, y las de carga baja con las dos accesiones de síntomas suaves iniciales débiles. Las 10 accesiones con síntomas intermedios mostraron una mayor carga viral a los 23 y 33 días post-inoculación (d.p.i.) cuando fueron infectadas con CGMMV de origen asiático (CG-SpCu16) respecto a las infectadas con la cepa de origen europeo (CGMMV-SP). Además, determinamos como la carga viral no varió de forma significativa a lo largo del tiempo en ninguna de las accesiones.
Hemos realizado también un estudio sobre la posible interacción de CGMMV-SP y el virus del rizado amarillo del tomate Nueva Delhi (Tomato leaf curl New Delhi virus, ToLCNDV) cepa española (ToLCNDV-ES) tras su inoculación mecánica (cada virus independientemente o ambos conjuntamente) en dos de sus hospedadores más habituales y que ambos virus comparten: pepino y calabacín. Por primera vez se estudia la interacción de estos dos virus no relacionados taxonómicamente entre sí y con distinto modo de transmisión. El análisis de resultados se basó en estudiar el número de plantas que desarrollaron síntomas típicos de la enfermedad para cada inoculación (confirmando la presencia del virus mediante RT-PCR para CGMMV-SP o PCR para ToLCNDV-ES), haciendo un análisis de diferentes características fenológicas de las plantas durante su desarrollo, y analizando la carga viral mediante RT-qPCR o qPCR a distintos d.p.i. Los resultados obtenidos indicaron que la carga viral de ToLCNDV-ES, tanto en pepino como en calabacín, se redujo cuando las plantas se coinfectaron con ambos virus simultáneamente. Además, en calabacín el número de plantas sintomáticas para ToLCNDV-ES fue mucho menor cuando las plantas fueron inoculadas con ambos virus simultáneamente respecto a las plantas inoculadas sólo con ToLCNDV-ES. Sin embargo, la carga viral de CGMMV-SP no se vio afectada ni se diferenció en las plantas, tanto pepino como calabacín, inoculadas únicamente con CGMMV-SP o cuando fueron inoculadas conjuntamente con CGMMV-SP y ToLCNDV-ES.
