Resumen de Identificación de nuevos marcadores moleculares y contribución de mecanismos de splicing en patologías tumorales endocrinas
1. Introducción o motivación de la tesis El cáncer es uno de los mayores retos que afronta la humanidad, pues comprende algunas de las patologías más graves que afectan a la salud a nivel mundial [1]. Aunque se están realizado grandes esfuerzos y se han logrado avances significativos en investigación básica, clínica y traslacional durante las últimas décadas, el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas en oncología, más globales y a la vez precisas y eficientes, está limitado por la enorme heterogeneidad y complejidad de esta enfermedad [2]. Para enfrentarse a dichas dificultades, Hanahan y Weinberg propusieron en el año 2000 y actualizaron en 2011 un grupo de alteraciones comunes compartidas por la mayoría de los tipos de cáncer a diferentes niveles, que se conocen como hallmarks o pilares del cáncer [3, 4]. Algunos de estos hallmarks están relacionados con la señalización hormonal, que se considera un componente importante en el control de la malignidad tumoral. En este contexto, la presente Tesis se ha enfocado fundamentalmente en el estudio de cánceres relacionados con el sistema endocrino, como el cáncer de próstata (CaP), fuertemente dependiente de la regulación hormonal, y distintos tipos de tumores neuroendocrinos (TNEs). El CaP es una de las patologías tumorales de mayor incidencia en hombres y una de las causas de muerte más comunes relacionadas con el cáncer en la población mundial [5, 6]. Por su parte, los TNEs son un grupo de neoplasias marcadamente heterogéneo, que surgen del sistema neuroendocrino difuso y se ha clasificado habitualmente según la localización del tumor. Concretamente, esta Tesis se enfoca en los tumores pancreáticos (PanNETs). Por último, analizaremos también un tipo tumoral estrechamente relacionado, los tumores neuroendocrinos hipofisarios (PitNETs) [7, 8].
Uno de los sistemas hormonales clásicamente relacionados con distintos tipos de tumores y que ha centrado el interés de nuestro grupo es el formado por la somatostatina y sus receptores (SST1-SST5) [9]. En particular, este sistema se ha relacionado con tumores neuroendocrinos (NET, PitNET), en los que los agonistas sintéticos de la somatostatina se emplean ampliamente para actuar sobre varios de sus receptores (ej. SST2, SST5) que sirven como efectivas dianas terapéuticas en esas patologías [10, 11]. En este contexto, destaca el reciente protagonismo del SST5 como posible diana de tratamiento con nuevos análogos de SST [12], y por la existencia de variantes de splicing truncadas del mismo (ej. SST5TMD4) relacionadas con agresividad tumoral en varios tipos de cáncer [13-17]. Sin embargo, se conoce muy poco acerca de la biogénesis del SST5 a partir de su gen SSTR5, así como del papel de otros receptores de somatostatina en patologías tumorales endocrinas.
El creciente descubrimiento de variantes de splicing anómalas que, como la mencionada SST5TMD4, se sobreexpresan en distintos tipos de cáncer apoya la idea de que la alteración del proceso de splicing puede estar involucrada en el desarrollo y la agresividad tumoral, a través de la desregulación del perfil normal de splicing alternativo y de la generación de variantes oncogénicas [18, 19]. De hecho, en los últimos años, la alteración del proceso de splicing se empieza a considerar como un nuevo hallmark transversal del cáncer, pues afecta a todos los hallmarks ya descritos [20]. No obstante, los datos disponibles sobre el splicing y su desregulación son aún escasos en muchas patologías tumorales, entre las que se incluyen los NETs.
Por todo lo expuesto, el objetivo general de esta Tesis ha sido determinar el papel que desempeñan los receptores de somatostatina y la maquinaria de splicing en distintos tipos de cánceres hormono-dependientes y tumores neuroendocrinos, así como los mecanismos de regulación subyacentes, con el fin último de descubrir nuevos biomarcadores y dianas farmacológicas con potencial para mejorar las aproximaciones diagnósticas y terapéuticas en esas patologías.
2. Contenido de la investigación En este contexto, la primera sección experimental de esta Tesis se centró en el estudio del papel del SST1 en CaP, explorando su presencia, alteración y posible papel funcional en esta patología. Los resultados mostraron una clara sobreexpresión de SST1 en muestras de CaP con respecto a las de próstata normal. Además, en las muestras tumorales, la expresión de SST1 se correlacionó con la del receptor de andrógenos (AR). Estudios in vitro con la línea celular de CaP 22Rv1 demostraron que el tratamiento con un agonista específico del SST1, BIM-23926, disminuyó la proliferación celular y la secreción de PSA de estas células. Asimismo, el silenciamiento de la expresión del SSTR1 incrementó, mientras que su sobreexpresión disminuyó, la proliferación de dicha línea celular. Mediante el uso de este agonista selectivo, estudiamos además las rutas de señalización implicadas en la función de SST1. El tratamiento con BIM-23926 disminuyó la fosforilación de AKT tras 30 min, mientras que no se observaron cambios en la activación de otras proteínas importantes, como ERK, AR o JNK, ni tampoco en los niveles de [Ca2+]i, un segundo mensajero clásico en la señalización hormonal. Un tratamiento prolongado (24 h) con este agonista disminuyó la expresión de ARNm de KLK3, el gen que codifica el PSA, y CCND3, un importante regulador del ciclo celular, así como la expresión del propio SSTR1, lo que parece indicar una autorregulación a través de un bucle negativo. Ese tratamiento también provocó cambios en rutas de señalización que se han relacionado con el AR; en concreto, la activación de SST1 inhibió la expresión de varios oncogenes (como ADAMTS1, VIPR) y estimuló la del supresor tumoral IGFBP5. Finalmente, análisis in silico revelaron que la expresión de SSTR1 podría estar regulada por varios miRNAs que correlacionan inversamente con este receptor en la base de datos The Cancer Genome Atlas (TCGA). Así, el tratamiento in vitro con uno de esos miRNAs, el miR-24, disminuyó los niveles proteicos y de ARNm de SST1 en las células 22Rv1, observándose además una correlación de la expresión de ambos genes en la base de datos Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC), que incluye muestras de metástasis.
La segunda sección experimental de esta Tesis se centró en el estudio de la regulación de la expresión del gen SSTR5 en NETs, incluyendo PitNETs (especialmente somatotropinomas) y PanNETs. En primer lugar, aproximaciones in silico revelaron que existe un transcrito natural antisentido (TNA) que se superpone al gen SSTR5 en el genoma, llamado SSTR5-AS1, y que hay cuatro islas CpG, regiones genómicas con una alta proporción de citosina-guanina, susceptibles de ser metiladas, entre esos dos genes. Aunque no se encontraron diferencias relevantes en la expresión de SSTR5-AS1 en PitNETs respecto a hipófisis normal, se observó que el gen SSTR5 sí se sobreexpresa en esa patología y, lo que es más interesante, que existe una marcada correlación directa entre la expresión de ambos genes (SSTR5/SSTR5-AS1) tanto en muestras de hipófisis normal como de somatotropinomas. Adicionalmente, descubrimos que la metilación de ADN en tres de las zonas CpG analizadas estaba alterada en somatotropinomas respecto a hipófisis normal. Es más, la metilación de una de dichas zonas, la que solapa con el centro del gran exón del gen SSTR5, incluyendo su zona de splicing alternativo, se correlacionó inversamente con la expresión tanto del receptor como de su antisentido en las muestras de somatotropinomas, pero no en las de hipófisis normal. En los PanNETs, observamos que el gen SSTR5-AS1 se sobreexpresa en muestras tumorales respecto a su tejido adyacente no tumoral, mostrando esta expresión una correlación directa con la de SSTR5 en ambos tejidos. Estos hallazgos nos impulsaron a realizar estudios in vitro, en la línea celular modelo de NETs BON-1, en las que observamos que el silenciamiento de SSTR5-AS1 disminuía, a su vez, la expresión de SSTR5, que, de nuevo, mostraba una correlación directa con la de su TNA. Más aún, dicho silenciamiento aumentó la proliferación celular y la formación de colonias, apoyando la idea de que este antisentido podría contribuir a la agresividad de las células de NETs. El efecto inhibidor del tratamiento con pasireotide, un análogo de somatostatina cuya diana predominante es el SST5, en los parámetros celulares citados, también se vio alterado por el silenciamiento de SSTR5-AS1. De hecho, el silenciamiento del TNA disminuyó la activación de ERK y AKT y, llamativamente, potenció el efecto del tratamiento con pasireotide sobre la fosforilación de dichas proteínas, apoyando la probable relevancia de SSTR5-AS1 en el control de la acción de SST5.
En la tercera sección experimental de esta Tesis, nuestro objetivo fue estudiar la desregulación de la maquinaria de splicing y su posible papel funcional en PanNETs, buscando nuevos biomarcadores y/o dianas terapéuticas para esta patología. Primero, medimos la expresión de un grupo de 45 componentes de la maquinaria de splicing en muestras de PanNETs, comparadas con el tejido adyacente no tumoral, utilizando un array de PCR cuantitativa basado en microfluídica. Aproximadamente, el 50 % de los genes medidos, incluyendo algunos ARN nucleares pequeños que conforman el núcleo de la maquinaria, se observó que estaban sobreexpresados en las muestras tumorales, mientras que solo un factor se encontró infraexpresado. Un análisis de componentes principales y otros ensayos bioinformáticos seleccionaron cinco de los genes medidos como aquellos con las mejores características de agrupamiento para distinguir entre muestras tumorales y no tumorales; dichos genes fueron: NOVA1, PRPF8, RAVER1, SRSF5 y SNW1. Además, observamos que los niveles de expresión de estos factores están asociados a importantes parámetros cínicos, como el índice Ki-67, necrosis, recidiva de la enfermedad, funcionalidad, pérdida de peso o invasión vascular. Uno de estos genes, NOVA1, mostró una curva ROC con un área mayor de 0,85 y su sobreexpresión en el tejido tumoral se confirmó a nivel proteico mediante inmunohistoquímica. Por ello, decidimos evaluar el posible papel funcional de este factor en las células de PanNETs. Así, descubrimos que la sobreexpresión de NOVA1 aumentó la tasa de proliferación in vitro de dos líneas celulares modelo de PanNETs, BON-1 y QGP-1, y estimuló el crecimiento de tumores xenotrasplantados de células BON-1 en ratones. En cambio, el silenciamiento de NOVA1 indujo en ambas líneas celulares una disminución de la proliferación, que estaba asociada a una reducción en la expresión de CCND1 y un aumento de la de CASP3. Del mismo modo, el silenciamiento de NOVA1 disminuyó la activación de ERK, PTEN y PDK1, sin alterar AKT, lo que sugiere que este factor puede actuar a través de acciones complejas y aparentemente contrapuestas. Curiosamente, el silenciamiento de NOVA1 aumentó la fosforilación de p53 solo en las células QGP-1, en las cuales, al mismo tiempo, disminuyó la expresión de la isoforma oncogénica Δ133TP53, sin alterar la canónica TP53. Estos resultados, junto con los expuestos sobre señalización, sugieren que NOVA1 puede desempeñar un papel relevante en la regulación de la ruta de senescencia, involucrando a p53 y ERK, de manera célula-específica. Por otro lado, la disminución génica de NOVA1 inhibió los niveles proteicos de ATRX y DAXX, así como la expresión de la isoforma truncada de TERT, lo que podría implicar a NOVA1 en la regulación de la ruta de remodelación de la cromatina, particularmente relevante en PanNETs. Es más, en la línea celular QGP-1 el silenciamiento de este factor de splicing mejoró el efecto antiproliferativo de everolimus, un inhibidor de mTOR ampliamente usado en el tratamiento de PanNETs.
3. Conclusiones Las principales conclusiones del trabajo presentado en esta Tesis son: 1. El gen SSTR1 se sobreexpresa en CaP, donde podría ejercer relevantes acciones y estar regulado por miRNAs específicos. En concreto, SST1 media la inhibición de la proliferación celular y la secreción de PSA en la línea celular de CaP 22Rv1, probablemente a través de rutas y mediadores relacionados con el AR, PI3K/AKT-CCND3.
2. La expresión de SSTR5 en somatotropinomas y PanNETs puede estar controlada por mecanismos epigenéticos, que incluyen tanto metilación del ADN como procesos postranscripcionales, como la regulación mediada por un antisentido. En concreto, SSTR5-AS1 podría contribuir a la regulación de características tumorales clave, tales como la proliferación, migración y formación de colonias, y en la respuesta al tratamiento con pasireotide, un análogo selectivo para SST5.
3. Los componentes de la maquinaria de splicing están profundamente alterados, en general sobreexpresados, en PanNETs. Los niveles de algunos de ellos están asociados a importantes parámetros clínicos y permiten distinguir con alta eficiencia entre muestras tumorales y no tumorales. En especial, altos niveles del factor de splicing NOVA1 provocan un aumento de la proliferación celular y la ruta de senescencia en modelos celulares de PanNETs, alterando rutas de señalización clave y comprometiendo la respuesta a everolimus.
Como conclusión general, los estudios presentados en esta Tesis permiten avanzar y profundizar en el conocimiento de las bases moleculares de la regulación fisiopatológica de cánceres hormono-dependientes y tumores neuroendocrinos por dos receptores específicos de somatostatina y por la maquinaria de splicing. Concretamente, nuestros resultados demuestran que SSTR1 en el caso de CaP, SSTR5 en NETs y el factor de splicing NOVA1 en PanNETs, constituyen puntos relevantes de regulación en estos tumores y como tales pueden servir como herramientas para el desarrollo de nuevos biomarcadores de diagnóstico y/o dianas terapéuticas para mejorar el futuro tratamiento de dichas patologías.
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