Resumen de Exploring the role of the haemoglobin from Bradyrhizobium diazoefficiens in nitric oxide detoxification during free-living and endosymbiotic lifestyles
- español
El óxido nítrico (NO) es un gas diatómico, formado por un átomo de oxígeno y otro de nitrógeno, con un electrón desapareado que lo convierte en un radical (Bartberger et al., 2002). El NO puede reaccionar con diferentes especies de oxígeno para formar las especies reactivas de nitrógeno (RNS) (Earnshaw y Greenwood, 1997). El NO está presente en todos los organismos vivos, donde puede actuar de forma diferente dependiendo de su concentración. A bajas concentraciones (niveles nmolares) el NO actúa como molécula señal, mientras que a concentraciones más altas (niveles µmolares) posee un efecto tóxico (Toledo y Augusto, 2012). En bacterias existen múltiples fuentes de NO, siendo la desnitrificación y la reducción desasimilativa de nitrato a amonio (DNRA) las principales fuentes respiratorias de NO (revisado en Torres et al., 2016). Además, debido al efecto tóxico del NO, las bacterias presentan diferentes sistemas y enzimas para su eliminación. Entre estos sistemas se encuentran las hemoglobinas, que son las proteínas mejor estudiadas y más importantes para la destoxificación aeróbica de NO en bacterias. En procariotas se han identificado tres tipos de hemoglobinas: flavohemoglobinas (fHb), hemoglobinas de dominio único (sdHb) y hemoglobinas truncadas (tHb) (revisado en Poole, 2005; Stern y Zhu, 2014; Gell, 2018).
Bradyrhizobium diazoefficiens es una α-proteobacteria, Gram-negativa, perteneciente al orden Rhizobiales. Esta bacteria es capaz de crecer en condiciones limitantes de oxígeno empleando el nitrato como única fuente de nitrógeno, para asimilarlo y/o para respirarlo actuando como aceptor final de electrones. En esta bacteria, la respiración de nitrato constituye la primera etapa del proceso de desnitrificación. Además, B. diazoefficiens es un diazótrofo que establece asociaciones simbióticas con plantas de soja (Glycine max). Esta asociación simbiótica tiene lugar en los nódulos, que son unas estructuras especializadas de la raíz de la planta. En los nódulos, las formas diferenciadas del rizobio, los bacteroides, son los responsables de fijar el N2 atmosférico mediante la actuación de la enzima nitrogenasa. B. diazoefficiens, además de fijar N2 en simbiosis, también es capaz de llevar a cabo el proceso de desnitrificación, tanto en vida libre como en los nódulos de soja. En esta bacteria, las reacciones de desnitrificación son catalizadas por las enzimas nitrato reductasa periplásmica (Nap), nitrito reductasa (NirK), óxido nítrico reductasa (Nor) y óxido nitroso reductasa (Nos), que reducen el nitrato hasta N2 mediante la formación de NO y óxido nitroso (N2O) como intermediarios gaseosos. Estas enzimas están codificadas por los genes napEDABC (Delgado et al., 2003), nirK (Velasco et al., 2001), norCBQD (Mesa et al., 2002) y nosRZDYFLX (Velasco et al., 2004), respectivamente (revisado en Bedmar et al., 2005, 2013).
Estudios previos, realizados en el Grupo del Metabolismo del Nitrógeno del Departamento de Microbiología del Suelo y Sistemas Simbióticos de la Estación Experimental del Zaidín (Granada), demostraron que la hipoxia y el nitrato inducen la formación de NO en nódulos de soja, siendo la desnitrificación en los bacteroides el principal proceso implicado en su formación. En este contexto, es preciso la existencia en el nódulo de mecanismos de destoxificación de NO, ya que se ha demostrado que el NO inhibe la actividad nitrogenasa, así como la expresión del gen nifH, responsable de su síntesis. En este sentido, se ha propuesto a la enzima desnitrificante Nor como la principal proteína implicada en la eliminación de NO en los nódulos de soja (Sánchez et al., 2010).
Además de desnitrificar, B. diazoeficciens es capaz de asimilar nitrato en vida libre mediante la expresión de un sistema coordinado de asimilación de nitrato y destoxificación de NO, codificado por el operón narK-bjgb-flp-nasC. Este operón es responsable de la síntesis de un transportador de nitrato/nitrito (NarK), una hemoglobina (Bjgb), una flavoproteína dependiente de NAD(P)H (Flp) y una nitrato reductasa asimilativa (NasC). Cerca de estos genes se encuentra otro operón que incluye genes que codifican para una nitrito reductasa asimilativa (NirA) y un sistema regulador de respuesta a nitrato/nitrito (NasST). Estudios previos han demostrado que Bjgb es una hemoglobina de dominio único implicada en la destoxificación de NO en células cultivadas en vida libre (Cabrera et al., 2016).
En esta Tesis Doctoral, se ha demostrado el papel in vitro de la hemoglobina Bjgb y la flavoproteína Flp de B. diazoefficiens en el metabolismo del NO.
Con este objetivo, se han clonado los genes bjgb y flp de B. diazoefficiens en plásmidos de expresión para posteriormente sobre-expresar y purificar las proteínas Bjgb y Flp. Una vez purificadas dichas proteínas, se ha realizado un estudio in vitro de las mismas mediante espectroscopía UV-Vis. Se ha confirmado la capacidad de la flavoproteína Flp de recibir electrones del NADH y de reducir a la hemoglobina de dominio único Bjgb. Una vez reducida la Bjgb, se ha demostrado que el grupo hemo de esta proteína es capaz de unir NO. Con estos resultados se ha demostrado la capacidad de Bjgb de unir NO in vitro, lo cual confirmaría el papel de esta proteína de destoxificar NO in vivo.
Además, se ha estudiado el papel de la lisina 52 de la Bjgb de B. diazoefficiens. Para ello, se ha realizado una mutación puntual mediante QuickChange de esta lisina por una alanina (K52A Bjgb). El análisis de la función in vivo de esta mutante se ha llevado a cabo mediante la complementación de la mutante bjgb de B. diazoefficiens con dos plásmidos, uno que sobre-expresa la proteína nativa Bjgb y otro que sobre-expresa la proteína mutante K52A Bjgb. La reducción de la expresión del promotor del gen norC, responsable de la síntesis de la enzima óxido nítrico reductasa, fue superior en la mutante bjgb que sobre-expresaba la Bjgb que en la mutante bjgb que sobre-expresaba la K52A Bjgb, cada una de ellas comparadas con la cepa mutante bjgb. Estos resultados se han verificado al medir niveles muy bajos, apenas detectables, de proteína NorC y de producción de N2O en la mutante bjgb que sobre-expresaba la Bjgb. Mientras que en la mutante bjgb que sobre-expresaba la K52A Bjgb se detectaron niveles de proteína NorC y de producción de N2O inferiores a los observados en la mutante bjgb. Estos resultados han demostrado que la lisina 52 de la Bjgb tiene un papel importante en homeostasis de NO in vivo.
En esta Tesis Doctoral, también se ha abordado el estudio de la implicación de la Bjgb de B. diazoefficiens en la interacción simbiótica con plantas de soja y en la homeostasis de NO en nódulos de soja. Mediante la técnica de la dilución isotópica del 15N y análisis de la actividad y expresión de la enzima nitrogenasa, se ha demostrado que las plantas de soja inoculadas con la cepa mutante en la hemoglobina tienen mayor tolerancia al encharcamiento que aquellas plantas inoculadas con la cepa parental. Este efecto beneficioso se debe a la reducción de la acumulación de NO en los nódulos producidos por plantas de soja inoculadas con la cepa mutante en la hemoglobina y sometidas a encharcamiento, en comparación con los nódulos encharcados de la cepa parental. Esta disminución en la acumulación de NO podría ser debida a la inducción de la expresión y actividad de la enzima óxido nítrico reductasa (Nor), la cual es la principal proteína implicada en la eliminación de NO en los nódulos de soja.
Por último, se ha estudiado la implicación en simbiosis del proceso de asimilación de nitrato. Para ello, se han utilizado las mutantes en los genes nasC y nirA, responsables de la síntesis de la nitrato reductasa y nitrito reductasa asimilativa, respectivamente. Mediante el análisis de la actividad nitrogenasa y contenido en leghemoglobina de los nódulos de soja, se ha demostrado que la inoculación de las plantas de soja con una cepa mutante nirA confiere protección de la fijación biológica de nitrógeno frente al encharcamiento, en comparación con aquellas plantas inoculadas con la cepa parental. Sin embargo, en las plantas inoculadas con la cepa mutante nasC y sometidas a encharcamiento no se observaron diferencias significativas en la fijación biológica de nitrógeno en comparación con aquellas plantas inoculadas con la cepa parental. Estos resultados, junto con el análisis de la actividad nitrato reductasa en bacteroides, han puesto de manifiesto que la principal enzima implicada en la reducción de nitrato en los bacteroides de nódulos de soja es la nitrato reductasa periplásmica (NapA). Con el objeto de profundizar en el posible papel de la asimilación de nitrato por los bacteroides en nódulos de soja, se ha utilizado una cepa de B. diazoeficciens mutante en el gen nifH, responsable de la síntesis de la Fe-proteína del complejo nitrogenasa. El análisis de la expresión del gen narK, el primer gen del operón que codifica para las enzimas implicadas en la asimilación de nitrato, demostró una significativa inducción de su expresión en nódulos de una cepa mutante nifH en relación con los niveles de expresión observados en los nódulos producidos por la cepa parental. Estos resultados se confirmaron mediante la detección de un incremento en el contenido en amonio de los nódulos de la cepa mutante nifH aislados de plantas cultivadas con nitrato, en comparación con los cosechados de plantas crecidas en ausencia de nitrato, donde no se detectó producción de amonio en los bacteroides. Por tanto, estos resultados sugieren que la asimilación de nitrato por los bacteroides podría tener una función relevante en nódulos de soja en aquellos casos en los que la fijación de nitrógeno esté dañada.
Los resultados obtenidos durante esta Tesis Doctoral han contribuido a incrementar el conocimiento sobre la función in vivo e in vitro de la proteína Bjgb de B. diazoefficiens en la destoxificación de NO, tanto en vida libre como en asociación simbiótica con plantas de soja. Además, se ha establecido el posible papel de las proteínas NasC y NirA de B. diazoefficiens en la asimilación de nitrato y nitrito en nódulos de soja.
- English
Nitric oxide (NO) is a diatomic gas, formed by an oxygen and nitrogen atom, with an unpaired electron, which turns it into a radical (Bartberger et al., 2002). This molecule may react with different oxygen species to form reactive nitrogen species (RNS) (Earnshaw and Greenwood, 1997). NO is present in all living organisms where it has different roles depending on its concentration. At low concentrations (nmolar levels) NO acts as a signalling molecule, while at higher concentrations (µmolar levels) it has a toxic effect (Toledo and Augusto, 2012). In bacteria, there are many sources of NO, being denitrification and dissimilatory reduction of nitrate to ammonium (DNRA) the main respiratory sources of NO (reviewed by Torres et al., 2016). Due to the toxic effect of NO, bacteria possess several systems and enzymes to remove it. Among these systems, the best studied and most important proteins for NO detoxification are the haemoglobins. In prokaryotes, three types of haemoglobins have been identified: flavohaemoglobins (fHbs), single domain haemoglobins (sdHbs) and truncated haemoglobins (tHbs) (reviewed by Poole, 2005; Stern and Zhu, 2014; Gell, 2018).
Bradyrhizobium diazoefficiens is a Gram-negative α-proteobacterium, belonging to the Rhizobiales order that establishes symbiotic associations with soybean plants (Glycine max). This symbiotic association takes places inside the nodules, which are specialized structures in the roots. In the nodules, the differentiated forms of rhizobium, the bacteroids, are responsible for fixing atmospheric N2 by the action of the nitrogenase enzyme. B. diazoeficciens is also able to grow under oxygen limiting conditions using nitrate as the only nitrogen source, to assimilate it and to use it as final electron acceptor through nitrate respiration that constitutes the first step of the denitrification pathway. In addition to fix N2 in symbiosis, B. diazoefficiens is also capable of performing denitrification process inside soybean nodules. In this bacterium, denitrification reactions are catalyzed by the periplasmic nitrate reductase (Nap), nitrite reductase (NirK), nitric oxide reductase (Nor) and nitrous oxide reductase (Nos), enzymes which reduce nitrate to N2 through the formation of NO and nitrous oxide (N2O) as gaseous intermediates. These enzymes are encoded by the napEDABC (Delgado et al., 2003), nirK (Velasco et al., 2001), norCBQD (Mesa et al., 2002) and nosRZDYFLX (Velasco et al., 2004) genes, respectively (reviewed by Bedmar et al., 2005, 2013).
Previous studies carried out in the Nitrogen Metabolism Group from Department of Soil Microbiology and Symbiotic Systems (Estación Experimental del Zaidín, CSIC), showed that hypoxia and nitrate induce NO synthesis in soybean nodules, being denitrification in bacteroids the major process involved in its formation. In this context, the presence of NO detoxification mechanisms in the nodules is necessary, since it has been evidenced that NO inhibits nitrogenase activity, as well as expression of nifH gene, responsible for its synthesis. The denitrifying enzyme Nor has been proposed as the principal protein implicated in NO removal in soybean nodules (Sánchez et al., 2010).
Besides to denitrify, B. diazoefficiens is able to assimilate nitrate in free living conditions through the expression of a coordinated system for nitrate assimilation and NO detoxification, which is encoded by the narK-bjgb-flp-nasC operon. This operon is responsible for the synthesis of a nitrate/nitrite (NarK) transporter, a haemoglobin (Bjgb), a NAD(P)H dependent flavoprotein (Flp) and an assimilatory nitrate reductase (NasC). Close to those genes, there is another gene cluster that includes genes coding for an assimilatory nitrite reductase (NirA) and a nitrate/nitrite response regulatory system (NasST). Earlier studies have revealed that Bjgb is a single domain haemoglobin involved in NO detoxification in cells grown under free-living conditions (Cabrera et al., 2016).
In this Doctoral Thesis, the role in vitro of B. diazoefficiens Bjgb and Flp in NO detoxification has been demonstrated. To achieve this goal, bjgb and flp genes from B. diazoefficiens have been cloned into expression plasmids to subsequently over-express and purify Bjgb and Flp proteins. UV-Vis spectroscopy characterization of purified Bjgb and Flp showed the ability of Flp to reduce Bjgb. Once Bjgb is reduced, the haem group of this protein is capable to bind NO. These results have proved the ability of Bjgb to bind NO in vitro confirming the role of this protein to detoxify NO in vivo.
The function of the lysine 52 of Bjgb has also been investigated by carrying out a site directed mutation of this lysine by an alanine (K52A Bjgb). The role in vivo of this K52A Bjgb mutant has been investigated by complementing a B. diazoefficiens bjgb mutant with two plasmids, one that over-expresses the native Bjgb and another that over-expresses the K52A Bjgb mutant protein. The analysis of Nor expression by using a norC-lacZ transcriptional fusion, detection of NorC protein and measuring the capacity of N2O production, the product of Nor, demonstrated that the lysine-52 haem-iron ligand from Bjgb has a critical role on nor expression and consequently on NO homeostasis in vivo.
In this Doctoral Thesis, the involvement of Bjgb from B. diazoefficiens in the symbiotic interaction with soybean plants and in NO homeostasis in the nodules has also been investigated. By using the isotopic 15N dilution technique and analyzing expression of nitrogenase, we have demonstrated that soybean plants inoculated with the bjgb mutant strain had greater tolerance to flooding than those plants inoculated with the parental strain. This beneficial effect is probably due to the reduction of NO accumulation in nodules produced by the bjgb mutant in response to flooding, as compared to parental flooded nodules. The decrease in NO accumulation could be resulting from the induction of expression and activity of the nitric oxide reductase enzyme (Nor), which is the main protein involved in NO removal in soybean nodules.
Finally, the involvement of nitrate assimilation in the B. diazoeficciens-Glycine max symbiosis has also been investigated in this Doctoral Thesis. To achieve this goal, B. diazoeficciens mutants defective in nasC and nirA genes, encoding the assimilatory nitrate and nitrite reductases, respectively, have been used to inoculate soybean plants. By analyzing nitrogenase activity and leghemoglobin content of the nodules, we found that inoculation with the nirA mutant confers protection of nitrogen fixation to flooding, compared to those plants inoculated with parental strain. However, no differences in nitrogen fixation were observed in plants inoculated with the nasC mutant and subjected to flooding compared to those plants inoculated with the parental strain. These results, together with the analysis of nitrate reductase activity in the bacteroids, suggest that the assimilatory nitrate reductase NasC has not a relevant role in nitrate reduction in bacteroids being the periplasmic nitrate reductase (NapA) the main enzyme involved. Interestingly, expression of narK gene, the first gene of the operon that codes for the enzymes implicated in nitrate assimilation, was significantly induced in nodules from a nifH mutant strain defective in the Fe-protein from nitrogenase complex. We also analyzed NH4+ production capacity by the bacteroids. As expected, nifH bacteroids from plants grown in the absence of nitrate, were unable to produce NH4+ due to the lack of nitrogenase activity. However, when plants were grown with nitrate, bacteroids from the nifH mutant were able to produce NH4+. These results suggest that nitrate assimilation by bacteroids might have a relevant role in those nodules where nitrogen fixation is impaired.
The results obtained during this Doctoral Thesis have contributed to increase the knowledge about the function in vivo and in vitro of Bjgb from B. diazoefficiens in NO detoxification, both in free living conditions and in symbiotic association with soybean plants. In addition, the putative role of B. diazoefficiens NasC and NirA assimilatory nitrate and nitrite reductases in soybean nodules has also been established.
