Desenvolupament de sistemes eficients d'expressió eucariota i bacteriana per a estudis funcionals de proteïnes recombinants d'interès biomèdic
- Autores: Laura Mariño Puertas
- Directores de la Tesis: Iñaki de Diego Martínez (dir. tes.), Theodoros Goulas (dir. tes.), Francesc Xavier Gomis-Rüth (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2020
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Maria Solà Vilarrubias (presid.), Cristina Ferrer Orta (secret.), David Reverter Cendrós (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Bioquímica, Biología Molecular y Biomedicina por la Universidad Autónoma de Barcelona
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TESEO
- Resumen
Al llarg aquesta tesi s’han fet molts esforços per desenvolupar un sistema d’expressió heteròloga de glicoproteïnes humanes d’alt rendiment, puresa i homogeneïtat, així amb la flexibilitat necessària per modificar la proteïna a voluntat. Hem desenvolupat dos sistemes d’expressió a eucariotes, uno a cèllules de Drosophila Schneider 2, per a l’expressió inductible mitjançant l’addició de Cu2SO4 i per a l’expressió transitòria amb transfecció de polietilenimina (PEI); i un per a mamífer, un sistema d’expressió transitòria basat en cèl·lules Expi293F i transfecció de PEI.
La proteòlisi és una part fonamental de la rotació de proteïnes en organismes vius i el seu desequilibri pot comportar malalties, provocant inflamacions, malalties neurodegeneratives, càncer o mort cel·lular entre altres trastorns. Per tant, els mecanismes que regulen l’activitat de la peptidasa s’han de regular de manera estricta per garantir l’activitat proteolítica adequada en el moment i lloc adequats.
La queilis-isozima 1 de la subtilisina humana (hSKI1) és la proteïna serina que catalitza el primer pas a l’activació proteolítica de les proteïnes d’unió de l’element regulador d’esterol (SREBPs), regulador clau del metabolisme dels lípids intracel·lulars. Aquesta proteasa és una proteïna transmembrana localitzada al reticle endoplasmàtic i l’aparell de Golgi i la seva maduració és un procés molt complex. Vam aconseguir una expressió soluble als sistemes d'expressió d'insectes i mamífers i establim les bases per a futurs estudis bioquímics i estructurals amb garanties d'èxit.
Al segon projecte, el principal inhibidor de la proteasa del plasma (la α2-macroglobulina humana, hα2M), que neutralitza un ampli espectre d’endopeptidases, però també modula l’activitat de les citocines, hormones, factors de creixement i altres proteïnes i, per tant, per tant té un gran impacte en la fisiologia humana. Es van realitzar assajos bioquímics, biofísics, estructurals i d’unió amb altres dianes interessants (Streptococcus GRAB, TGFβ2 humà i LRP1 humà) en complexos amb hα2M autèntics i recombinants per a caracteritzar aquestes interaccions. Per tant, també vam expressar les variants hα2M en cèl·lules eucariotes i vam purificar l’autèntica proteïna de la sang.
A més, expressem pro-TGFβ2 a cèllules d'insecte i mamífer i cristalizamos la forma madura de TGFβ2.
I finalment, vam revisar la literatura disponible sobre la família de les metaloproteinases de matriu (MMP) fora de vertebrats i vam realitzar cerques a la base de dades de dominis catalítics de MMP potencials en invertebrats, plantes, fongs, virus, protistes, arqueus i bacteris.
En general, la present tesi ha establert nous i prometedors sistemes d’expressió al laboratori, que han beneficiat i ha contribuït substancialment al camp als nivells d’expressió, purificació i cristal·lització de la proteïna serina hSKI1 i l’inhibidor de la proteasa hα2M, sols o interactuant amb GRAB i TGFβ2.
