Regulación de la movilidad mediada por flagelos en Pseudomonas fluorescens F113

• Autores: Ana Navazo Alonso
• Directores de la Tesis: Marta Martín Basanta (dir. tes.), Rafael Rivilla Palma (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2011
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Ildefonso Bonilla Mangas (presid.), Belén Brito (secret.), Emilia López Solanilla (voc.), Cayo Ramos Rodríguez (voc.), Maria Isabel Ramos-Gonzalez (voc.), Francisco Manuel Cazorla López (voc.), María Sánchez Contreras (voc.)
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: digitool-uam.greendata.es
• Resumen

  • La rizosfera, porción del suelo íntimamente asociada a la raíz de las plantas, es un nicho ecológico adecuado para multitud de microorganismos, debido a los exudados que la planta secreta a través de sus raíces. Estos microorganismos pueden establecer relaciones beneficiosas con la planta, como es el caso de las PGPR, pero para que puedan ejercer su acción es necesario que sean capaces de colonizar eficientemente la rizosfera. Entre otros, se ha descrito que la movilidad, la adhesión y la acción de enzimas con actividad recombinasa del ADN, son importantes para llevar a cabo dicha colonización. Durante este proceso se ha observado que en la rizosfera de alfalfa, P. fluorescens F113 sufre variación fenotípica, caracterizada por la aparición de variantes más móviles que la cepa silvestre, y que la desplazan del ápice radicular en ensayos de colonización competitiva. Estos variantes hipermóviles portan entre otras, mutaciones en el sistema de dos componentes GacA/GacS, regulador del metabolismo secundario y que reprime la capacidad de movimiento en F113. Mediante mutagénesis al azar con transposones encontramos cinco mutantes que mostraban mayor movilidad que la cepa silvestre y presentaban interrumpidos genes cuyos productos presentaban homología con las proteínas KinB, SadB, WspC, WspE y WspR. KinB es la proteína sensora de un sistema de dos componentes que regula la síntesis del polisacárido alginato. Mientras que SadB y WspR parecen estar relacionados con el metabolismo del segundo mensajero di-guanosín-monofosfato cíclico (di-GMPc). Los ensayos de epistasia demostraron que las rutas en las que participan los genes gacS, sadB y wspR son independientes, ya que tanto los dobles como el triple mutante mostraron un fenotipo aditivo en cuanto a la movilidad tipo swimming y swarming. Además, la expresión del gen fleQ, el regulador principal de los componentes de la síntesis del flagelo en pseudomonas y de FliC (flagelina), era mayor en los mutantes gacS- y sadB- con respecto a la estirpe silvestre, no existiendo diferencias entre la cepa silvestre y el mutante wspR-.

    Esta cepa presenta genes que codifican proteínas Rsm, y ARNs rsm de pequeño tamaño, homólogos a los descritos en otras pseudomonas. La sobreexpresión de proteínas Rsm en F113 produce un incremento en la movilidad y en la expresión de los genes fleQ y fliC, un fenotipo idéntico al de los mutantes gac-. Al haberse descrito AmrZ como un represor de fleQ en P. aeruginosa, y a AlgU (¿22), como el factor sigma necesario para la expresión de amrZ, se construyeron mutantes en estos genes en P. fluorescens F113, mostrando ambos un fenotipo hipermóvil similar y altos Resumen 4 niveles de expresión de fleQ y fliC. En cuanto a los ensayos de interacción génica comprobamos que algU, amrZ y gacS actúan en la misma ruta de regulación de la movilidad, al igual que los genes algU, amrZ y sadB. El doble mutante gacS-sadB- mostraba un fenotipo de movilidad tipo swimming aditivo con respecto al de los mutantes simples, por tanto, las rutas en las que están implicados la proteína SadB y el sistema Gac/Rsm convergen a nivel de la regulación de algU.

    En cuanto a la ruta en la que participa el sistema Wsp, se ha descrito que WspR, la proteína efectora del sistema, presenta actividad diguanilato ciclasa, aumentando los niveles intracelulares de di-GMPc. Proteínas con dominios PilZ son capaces de unir di-GMPc y afectar a la velocidad de rotación del flagelo en otras especies. El genoma de P. fluorescens F113 presenta un gen denominado flgZ, cuyo producto contiene un dominio PilZ, y es homólogo a la proteína YcgR de enterobacterias. Además, mediante microscopía confocal comprobamos que FlgZ se sitúa en el polo flagelado de la bacteria, siendo su localización dependiente de los niveles de di-GMPc. Sabiendo que tanto el sistema Wsp, como el formado por SadC/BifA, con actividades diguanilato ciclasa y fosfodiesterasa respectivamente modulan los niveles de di-GMPc en otras pseudomonas, construimos mutantes simples y dobles en estos genes. Mediante análisis genético comprobamos que SadC y BifA forman parte de una única vía de regulación de la movilidad, y que la proteína FlgZ integra las señales de las rutas en las que están implicados de forma independiente los sistemas Wsp y SadC/BifA, siendo estas rutas independientes de aquellas en las que participan el sistema Gac y SadB. En cuanto a la formación de biopelículas los mutantes wspR- y sadC- presentan una menor capacidad de adhesión al sustrato, mientras que en bifA- esta capacidad es mucho mayor. El hecho de que los dobles mutantes wspR-flgZ-, sadC-flgZ- y bifA-flgZ- muestren el mismo fenotipo de adhesión entre sí, y que el mutante flgZ- parece indicar que la proteína FlgZ tiene un papel clave en la transición de los estilos de vida de móvil a sésil en la cepa P. fluorescens F113.

    Así, podemos afirmar que la movilidad en la cepa P. fluorescens F113 se encuentra reprimida por múltiples rutas de señalización que forman en conjunto una compleja red de regulación a varios niveles: biosíntesis de flagelos y control de su funcionalidad.