Caracterización de la exo-endocitosis y de la dinámica del poro de fisión en mastocitos
- Autores: Jose María Cabeza Fernández
- Directores de la Tesis: Eva Alés González de la Higuera (dir. tes.), María Luz Montesinos Gutiérrez (tut. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2013
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Juan Ribas-Serna (presid.), Rafael Fernández Chacón (secret.), Luis Miguel Gutiérrez Pérez (voc.), Manuela García López (voc.), Antonio Rodríguez (voc.)
- Materias:
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- Resumen
Los mastocitos constituyen un tipo celular ampliamente estudiado en el contexto de de la inflamación alérgica. Poseen un receptor de alta afinidad que, tras unirse a la inmunoglobulina E, forma el receptor de antígeno de la célula. La interacción con el antígeno causa la degranulación del citoplasma, lo que incrementa la permeabilidad vascular e induce la broncoconstricción. Sin embargo, los mastocitos participan en varias reacciones biológicas, tanto patológicas como fisiológicas, aparte de la inflamación alérgica causada por la inmunoglobulina E ya que sus gránulos contienen, además de histamina, otras muchas sustancias. Las células empleadas en esta tesis doctoral han sido mastocitos peritoneales de ratón, obtenidos mediante un lavado del peritoneo del animal con solución salina.
La exocitosis es el proceso celular mediante el cual las vesículas citoplásmicas se fusionan con la membrana citoplasmática y liberan su contenido al medio extracelular a través de un estrecho canal acuoso conocido como poro de fusión. Este poro de fusión puede expandirse por completo, fenómeno conocido como fusión completa y que conduce a la incorporación de la membrana de la vesícula a la membrana celular, o puede volver a cerrarse, quedando así la vesícula libre de nuevo en el citoplasma constituyendo así un mecanismo conocido como ¿kiss-and-run¿. La membrana de las vesículas que se incorpora a la membrana plasmática por exocitosis debe ser recuperada mediante la endocitosis para mantener un tamaño celular constante y recapturar componentes de la membrana vesicular. El poro que conecta la vacuola endocítica y la membrana plasmática se conoce como poro de fisión. Los mecanismos de exo-endocitosis son responsables de regular numerosos fenómenos biológicos de gran importancia, razón por la cual son bien coordinados, altamente regulados y finamente modulados por una orquesta de biomoléculas. Entre otras, se encuentran las proteínas sinaptotagmina, dinamina, actina y miosina, además del calcio intracelular.
La técnica de ¿patch-clamp¿ permite monitorizar en tiempo real la capacidad y la conductancia de la membrana celular, ofreciendo una resolución temporal mucho más rápida que las técnicas de imagen, ya que es del orden del milisegundo. Dado que la capacidad es proporcional a la superficie de la membrana, la exocitosis y la endocitosis se reflejan como un incremento y un decremento en la capacidad celular, respectivamente. Este método también permite obtener información sobre la conductancia y la cinética de los poros de fusión y fisión.
La amperometría es un método electroquímico que sirve para estudiar la liberación de sustancias. Se fundamenta en la oxidación de las moléculas secretadas al entrar en contacto con un electrodo de fibra de carbono sometido a voltaje.
En nuestros experimentos hemos potenciado la endocitosis dializando la célula con una solución hipotónica. Asimismo, también empleamos la técnica del parche perforado. Ambos enfoques coincidieron y nos han permitido describir la existencia de dos poblaciones de vesículas de endocitosis, una probablemente formada por la recaptura relativamente rápida de vesículas únicas previamente fusionadas con la membrana plasmática y otra generada por la internalización de grandes áreas de membrana mediante un mecanismo de endocitosis lenta conocido como endocitosis masiva.
Las variaciones de capacidad más pequeñas (inferiores a 40 fF) no se ven acompañados de un claro cambio en la conductancia. Sin embargo, los eventos de mayor entidad se superponen frecuentemente a un cambio transitorio de la conductancia. Estas variaciones de la capacidad y la conductancia se explican mediante la formación de un poro. De hecho, a partir de los componentes de la admitancia celular, el imaginario (proporcional a la capacidad) y el real (proporcional a la conductancia), es posible calcular la conductancia del poro. Además, modelado el poro como un conductor eléctrico de un diámetro y una longitud determinados, puede interpretarse en términos geométricos el curso temporal de la conductancia del poro. De este modo, y a partir de datos coincidentes obtenidos mediante célula entera con solución hipotónica y parche perforado, hemos elaborado un modelo de cierre del poro de fisión en tres fases secuenciales de estrechamiento, elongación y cierre. Es decir, en primer lugar el poro se estrecha en diámetro, a continuación se alarga y, finalmente, colapsa cerrándose por completo.
El efecto de la [Ca2+]i, en la aceleración de la fisión de membranas se ha demostrado con anterioridad; sin embargo, hasta ahora, no se ha estudiado la habilidad de la [Ca2+]i para incrementar la velocidad de constricción y elongación del poro de fisión. Nuestros resultados demuestran que el calcio citoplásmico acelera la primera y segunda fase del cierre del poro, sugiriendo que existe una contribución calcio-dependiente de la constricción y elongación del poro previas a la escisión de la vesícula de la membrana plasmática. El diámetro del poro no se ve afectado por el calcio. Sin embargo, la presencia de elevadas concentraciones de [Ca2+]i, produce un significativo incremento de la longitud final del poro. Un posible mecanismo para los efectos del calcio en la endocitosis es a través de la actividad de la dinamina. Esta proteína es dependiente de calcio y forma un collar helicoidal alrededor del cuello de una vesícula en formación dónde puede constreñir físicamente la membrana o experimentar una extensión longitudinal que hace que la vesícula se separe de la membrana causando de este modo la fisión de los lípidos. La dinamina acelera la primera y segunda fases del cierre del poro de vesículas endocitóticas pequeñas (¿ 80 fF). Sin embargo, no parece presentar efecto alguno sobre la tercera ni sobre ninguna de las fases de los ¿eventos grandes¿ (¿ 80 fF).
Otra de las proteínas implicada en la endocitosis, entre muchas otras funciones, es la actina. Así, la polimerización de la actina está relacionada con la generación de la fuerza de tracción que hace que la membrana se mueva hacia el interior celular durante la invaginación y es esencial en el proceso de la endocitosis masiva. En las células tratadas con un inhibidor de la polimerización de actina, la citocalasina-D, detectamos tan escaso número de poros de fisión que no nos fue posible determinar el papel de esta proteína sobre el poro. La polimerización de actina debe ser esencial en las fases iniciales de la endocitosis, en la formación de la invaginación. En ese momento, el poro de fisión no está completamente formado y aún no podemos detectarlo mediante la técnica de ¿patch-clamp¿.
La exocitosis es un proceso dependiente de calcio. Se necesita, pues, un sensor de calcio en la zona de exocitosis para desencadenar la fase final de la fusión. Uno de estos sensores moleculares está constituido por las sinaptotagminas (Syt), que son proteínas asociadas con vesículas secretoras y a las que se les ha atribuido una función en el proceso de anclaje vesicular y en etapas posteriores de la liberación de los mediadores. La dinámica del poro de fusión también está afectada por la sobreexpresión o mutación de diferentes isoformas de sinaptotagmina. Así, se ha publicado que el calcio acelera la apertura y la dilatación del poro de fusión y, por lo tanto, la liberación del contenido vesicular, a través de su unión a la sinaptotagmina. Nuestros estudios indican que la sinaptotagmina VII no determina la exocitosis en mastocitos, pero el mayor número de eventos transitorios registrados en las células Syt VII C2B KI induce a pensar que podría modular la manera en la que tiene lugar la exocitosis en un modo similar al que se ha postulado para células cromafines.
Normalmente, las vesículas secretoras fusionan con la membrana plasmática independientemente unas de otras, lo que se conoce como exocitosis simple. Sin embargo, las vesículas pueden fusionan entre sí antes de fusionar con la membrana plasmática, lo que constituye la exocitosis compuesta, o fusionar con una vesícula ya fusionada con la membrana plasmática formándose así un saco de degranulación, lo que se llama exocitosis acumulativa. Se piensa que recapturar cavidades secretoras intactas de un modo similar al del ¿kiss-and-run¿ es ventajoso para las células porque les evita el gasto energético de la endocitosis convencional. Nosotros hemos presenciado una actividad exo-endocitótica que podríamos interpretar como exocitosis acumulativa y ¿cavicaptura¿. Mediante este mecanismo la vesícula fusiona por completo con la membrana plasmática al mismo tiempo que conserva la forma de omega y, posteriormente, vuelve a endocitarse .Hasta donde sabemos, esta dinámica de membrana constituye la primera demostración directa, mediante análisis de admitancia, de la "cavicaptura" propuesto por Henkel y Almers y confirmado posteriormente por análisis de imagen en células secretoras de insulina y células PC12.
Las diferentes isoformas de miosina conforman una familia de proteínas motoras dependientes de ATP responsables de la movilidad basada en actina. Son más conocidas por su implicación en la contracción muscular, pero median otros muchos procesos de movilidad en eucariotas. Varios de estos procesos participan en la exo-endocitosis.
La presencia de blebistatina, inhibidor de la miosina, no produjo ningún efecto sobre el tamaño de capacidad correspondiente a las fusiones completas ni a las transitorias. Tampoco presenta actividad sobre el tiempo de vida de los eventos de tipo ¿kiss-and-run¿. Sin embargo, la blebistatina aumenta el tiempo de subida y caída de los eventos irreversibles y enlentece la velocidad del proceso de fusión en eventos exocitóticos irreversibles y reversibles. Los poros de fisión registrados bajo administración de blebistatina son similares a los obtenidos en condiciones control. En primer lugar, tendría lugar un estrechamiento del poro en diámetro y, a continuación, una extensión longitudinal del mismo. Sin embargo, la blebistatina enlentece tanto la primera como la segunda fase del cierre, por lo que aumenta la duración de los poros de fisión. Además, en la mayoría de casos no se produce la escisión final de la tercera fase sino que el poro permanece estático indefinidamente, formando un pequeño enlace entre la vesícula endocitótica y la membrana plasmática.
