Expresion en sistemas heterologos de una rhbmp-2 modificada con un dominio de afinidad por el colageno tipo i para su posible uso en medicina regenerativa
- Autores: Pilar M. Arrabal García
- Directores de la Tesis: Manuel Cifuentes Rueda (dir. tes.), Enrique Guerado Parra (dir. tes.), José Becerra Ratia (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Málaga ( España ) en 2008
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: José Manuel Fernández-Fígares Pérez (presid.), Leonor Santos Ruiz (secret.), María Aránzazu Díaz Cuenca (voc.), Maria Angeles del Brio Leon (voc.), José Luis Peris Serra (voc.)
- Materias:
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- Resumen
En la presente tesis se han utilizado dos sistemas de expresión de proteínas para realizar la producción de una de las llamadas "proteínas morfogénicas del organismo". Se trata de factores de crecimientos que ejercen múltiples funciones en el organismo desde el desarrollo del embrión hasta procesos regenerativos en el adulto. La importancia de estas proteínas se debe a su potencial uso terapéutico en la clínica humana para favorecer fenómenos de regeneración. Dado que se trata de proteínas homodiméricas que contienen varios puentes disulfuro y cadenas glucídicas, para obtener las proteínas en condiciones más parecidas a la proteína humana hemos utilizado el sistema de expresión de células de insecto Sf9 transfectadas con baculovirus. El gran interés que ha despertado el uso de los baculovirus como vectores para la expresión de proteínas recombinantes en células de insecto, se debe a que estas células proveen de un ambiente eucariota propicio para que ocurra un plegamiento correcto de la proteína, realizando modificaciones post-traduccionales tales como fosforilaciones, N- y O-glucosilaciones, formación de puentes disulfuro, etc., de manera muy parecida a las células de mamífero. Por todo ello la obtención de moléculas biológicamente activas implica menor manipulación que los sistemas de expresión en bacterias o levaduras y las cantidades que se obtienen, por lo general, son mayores que las obtenidas en sistemas de expresión de mamíferos. A pesar de todas estas ventajas y de la obtención de una forma dimérica de la proteína cuyo peso molecular coincide con el esperado la primera conclusión obtenida es que "la expresión heteróloga de estas proteínas mediante el sistema de expresión de células de insecto Sf9 transfectadas con baculovirus, no parece ser viable bajo las condiciones utilizadas en este trabajo; el plásmido que aporta el péptido señal o el uso del promotor tardío de la poliedrina provocan cambios en la estructura proteica de tal importancia, que el producto resultante carece de la actividad biológica esperada".
A tenor de lo poco efectiva que resultó la expresión de las proteínas de interés en el sistema eucariótico de células de insecto decidimos producir las proteínas recombinantes en un sistema de expresión procariota más simple que no realiza modificaciones post-traduccionales como es el de E. coli, aunque ello implicara mayor manipulación de las proteínas in vitro para conseguir su correcto plegamiento y lograr que sean activas biológicamente; en este caso podemos concluir que "el sistema de expresión de E. coli, produce de forma eficiente las proteínas objeto de nuestro interés. El método de replegamiento y purificación descritos por otros autores para otras proteínas de semejante naturaleza, es igualmente efectivo para la producción de nuestras proteínas".
Por último se realizaron ensayos de actividad biológica in vitro e in vivo para comprobar la actividad morfógena de estas proteínas permitiéndonos concluir que "las proteínas producidas en el sistema de expresión de E. coli, presentan actividad biológica comparable, in vitro, a las proteínas producidas en células de mamíferos CHO; y la actividad biológica in vivo se ve sensiblemente aumentada, por lo que se trata de un buen candidato para su uso terapéutico".
