Patrón de expresión de micrornas en plasma de pacientes con cáncer de pulmón de célula no pequeña subtipo no epidermoide en estadío avanzado con metástasis cerebrales
- Autores: Francisco Aparisi Aparisi
- Directores de la Tesis: Oscar José Juan Vidal (dir. tes.), Maria Dolores Sánchez Izquierdo (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir ( España ) en 2016
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Carlos Camps Herrero (presid.), José Marcelo Galbis Caravajal (secret.), Jaime Font de Mora Sainz (voc.)
- Materias:
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- Resumen
INTRODUCCION: el cáncer de pulmón es el tumor más prevalente en cuanto a mortalidad e incidencia en el mundo occidental. El principal factor de riesgo para el cáncer de pulmón es el tabaco que se relaciona con el 90% de los casos. La cirugía es el tratamiento estándar para los pacientes con un tumor localizado pero la mayor parte de ellos se diagnostican cuando la enfermedad tiene metástasis donde la quimioterapia es el pilar fundamental. Se han hecho muchos avances desde entonces identificando subgrupos moleculares con tratamientos diana. Pero cuando aparecen metástasis cerebrales el pronóstico empeora y ha habido pocos avances.
La primera causa de formación de metástasis cerebrales es el cáncer de pulmón, con una incidencia entre el 30-43%. En base al estudio del Radiation Therapy Oncology Group (RTOG), los pacientes con metástasis cerebrales tratados con radioterapia, se pueden asignar a tres clases funcionales, orientando a supervivencias de 2.3 meses en el grupo de peor pronóstico, a 7.1 meses en el grupo de mejor pronóstico y a 4.2 meses en el grupo intermedio. La valoración pronóstica escalonada diagnóstico específica (DS-GPA) para el cáncer de pulmón establece una supervivencia de 3 meses en el grupo de peor pronóstico y en 14.7 meses en el grupo de mejor pronóstico.
Los microRNAs (miRNAs) son ácidos nucleicos de pequeño tamaño (19-25 nucleótidos de longitud) y altamente estables que forman parte del ARN no codificante. Están implicados en procesos fundamentales para la célula como es la diferenciación, proliferación, apoptosis o respuesta al estrés. Actualmente se han registrado más de 2500 miRNAs humanos y su número está aumentando rápidamente. Los miRNAs se expresan en todos los tipos celulares estudiados y pueden ser utilizados como marcadores de enfermedad, de progresión o de pronóstico.
Una biopsia líquida es una muestra de muchos fluidos corporales (sangre, saliva, orina, ascitis, derrame pleural, etc.) que contiene un biomarcador que puede ser fácilmente aislado. Los exosomas son pequeñas vesículas de membrana de origen endocítico secretadas por la mayoría de tipos de células. Se está demostrando que juegan un papel importante en la comunicación intercelular. Aunque los exosomas están descritos en cáncer desde 1979, el interés en estas vesículas ha aumentado muy considerablemente en los últimos 3 años, después de que ha descubierto que transportan mRNA y miRNA.
Aunque hay escasos estudios que intenten demostrar en tejido tumoral o in vivo /in vitro la relación de algunos miRNAs con el desarrollo de metástasis cerebrales en cáncer de pulmón de célula no pequeña (CPCNP), la dificultad de acceder al tejido tumoral en este perfil de pacientes, hace especialmente atractivo investigar posibles implicaciones de miRNAs exosomales en sangre periférica a modo de biopsia líquida ya que los exosomas se han demostrado como potenciales reguladores del organotropismo de las metástasis. Pero hasta la fecha no se publicado ningún estudio que intente encontrar un patrón diferenciador de miRNAs exosomales en plasma, para usarlo como biomarcador de la presencia de metástasis cerebrales en cáncer de pulmón.
HIPÓTESIS DE TRABAJO: la hipótesis de este trabajo es que el perfil de expresión de miRNAs circulantes puede identificar aquellos pacientes con cáncer de pulmón de célula no pequeña con metástasis cerebrales de aquellos que no tienen metástasis cerebrales.
OBJETIVO PRINCIPAL: establecer el valor predictivo del patrón de miRNAs en plasma en pacientes con cáncer de pulmón de célula no pequeña no epidermoide enfermedad avanzada con metástasis cerebrales validado por tecnología de microarrays.
OBJETIVOS SECUNDARIOS: inferir si será posible la correlación de dicho patrón con: 1. Pronóstico 2. Clínica 3. Parámetros de laboratorio 4. Parámetros moleculares (EGFR, ALK) 5. Medicación concomitante 6. Hábito tabáquico MATERIAL Y MÉTODOS: se recogieron de forma prospectiva 63 muestras de plasma de pacientes con cáncer de pulmón no microcítico avanzado no epidermoide con o sin metástasis cerebrales que no habían recibido ni tratamiento quimioterápico ni radioterápico vistos en los servicios de oncología médica de los hospitales de Elda, Arnau de Vilanova, Xàtiva, La Fe y Alcoy en la primera visita basal en dichos servicios durante 22 meses. Las muestras recolectadas se gestionaron en una colección bajo régimen proyecto en el biobanco La Fe. Se realizaron varias simulaciones mediante el método de Monte Carlo para estimar la capacidad de encontrar asociaciones entre las variables predictivas y la respuesta obteniéndose que, para encontrar efectos de asociación de un tamaño medio-alto o superior sería necesario un tamaño muestral mínimo de 30 individuos. Teniendo en cuenta que se esperaba alrededor de un 31% de pérdidas, se analizarían 44 individuos y se reclutaría el máximo número de individuos en el periodo analizado. Se realizó un análisis de estadística descriptiva de las 63 muestras con el Paquete estadístico R (versión 3.2.2); un análisis de supervivencia y miRNAs (44 muestras) R survival (versión 2.38-3) y glmnet (versión 2.0-2) y el análisis de los perfiles de expresión de ARNs pequeños obtenidos mediante análisis de microarrays de 44-30 muestras con la tecnología Expression console de Affymetrix y Partek Genomic Suite.
RESULTADOS: La mediana de supervivencia de la serie fue 13,2 meses, siendo 17.8 meses si solo hay metástasis extra cerebrales; 6.87 meses si hay solo metástasis cerebrales y 4.1 meses si hay enfermedad metastásica cerebral y extracerebral conjunta. La diferencia fue estadísticamente significativa (p = 0.034). Se asociaron a mejor pronóstico: hsa.mir.7853; ENSG00000238526 y hsa.mir.515.1. Se asociaron a peor pronóstico: hsa.miR.454.5p; hsa.miR.615.5p; y HBII.52.22. El análisis mediante el paquete genomic suite de partek para descubrimiento y análisis estadístico de datos masivos generados en los arrays de expresión mostró un sesgo en función del día de extracción de los exosomas que se debió al uso de diferente volumen de plasma de partida: 2 ml en la primera extracción y 1 ml en la 2º y 3º extracción. Aunque se aplicó la eliminación del efecto sesgo ( BEG) se decidió usar solo las 30 muestras de la 2º y 3º extracción, lo que dio un patrón de 127 miRNAs que eran estadísticamente significativos para variante localización cerebral oligometástasica y extra cerebral y cerebral no exclusiva frente a localización metastásica no cerebral. 9 de los 127 miRNAs tuvieron unas veces de cambio superiores a 1.5.
DISCUSION: El problema de las metástasis cerebrales en CPCNP ha sido muy poco estudiado. El número de artículos es limitado. De estos, la mitad son pruebas en modelos in vitro y solo los 7 restantes se basan en muestras de tejido tumoral, con comprobación in vitro/ in vivo posterior de la ruta biológica propuesta. Estos 7 artículos acaban implicando 3 miRNAs en tejido tumoral: miR-145; miR-328 y miR-378. En el momento en que hemos realizado el análisis de miRNAs hay 70 miRNAs de los cuales no se ha encontrado información biológica.
34 miRNAs aparecen con una expresión disminuida e información biológica. Nos hemos centrado en 5 de ellos por los siguientes motivos: miR-328p ha sido demostrado como uno de los 3 miRNAs que la bibliografía existente relaciona con CPCNP y metástasis cerebrales; let-7A -1 y let-7F-2-3P, por ser dos de los miembros de la familia let que fue el primer miRNA relacionado con cáncer de pulmón ; miR-195 por ser un supresor de tumores con abundante información oncogénica; y miR-877-5P por ser el miRNA con información biológica que tiene el valor de veces de cambio más extremo con expresión disminuida.
23 miRNAs se muestran con una expresión aumentada e información biológica. Nos hemos centrado en 3 de ellos por los siguientes motivos: miR-378D ha sido demostrado como uno de los 3 miRNAs que relacionan CPCNP y metástasis cerebrales; miR-145-5P por ser el tercer miRNA relacionado con CPCNP y metástasis cerebrales y miR-1275 por ser el miRNA con información biológica que tiene el valor de veces de cambio más extremo con expresión aumentada.
CONCLUSIONES: 1. En nuestra serie de pacientes con y sin metástasis cerebrales de CPCNP subtipo no epidermoide hemos encontrado un patrón de expresión diferencial en plasma de 127 ARNs no codificantes cumpliendo el objetivo primario del trabajo.
2. Este patrón de 127 ARNs no codificantes, no se correlaciona en nuestra serie con otras variables cumpliendo los objetivos secundarios del trabajo.
3. Este trabajo representa los resultados del primer estudio hasta la fecha que intenta demostrar la relación de un patrón de expresión de miRNAs en exosomas de plasma de pacientes con CPCNP subtipo no epidermoide predictivo de metástasis cerebrales.
4. De los ARNs diferencialmente expresados, existen tres miRNAs relacionados con CPCNP aunque no es posible correlacionar si se encuentran aumentados o disminuidos: a. miR-145 se relaciona con EGFR, OCT-4, MUC-1 y C-MYC.
b. miR-328 se relaciona con PRKCA.
c. miR-378 está relacionado con VEGF.
5. Se ha encontrado una justificación biológica también para: let-7a -1, let-7f-2-3p, miR-195, miR-877-5p y miR-1275: a. let-7a -1 y, let-7f-2-3p, supresores de tumores afectando diferentes vías.
b. miR-195 relacionado con IGF1R, HDGF, MYB o CHEK-1.
c. miR-877-5p relacionado con FOXM1.
d. miR-1275 relacionado con CLDN11
