Optimización de las señales de ERK mediante transfosforilación entre diferentes proteínas scaffold: implicaciones en terapia antitumoral

• Autores: Ana Martín Vega
• Directores de la Tesis: Piero Crespo (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Cantabria ( España ) en 2020
• Idioma: español
• Títulos paralelos:
  • Optimization of ERK signalling by transphosphorylation across different scaffold protein species: implication in cancer therapeutics
• Tribunal Calificador de la Tesis: José Carlos Rodríguez Rey (presid.), Adán Pinto Fernández (secret.), José Lozano Castro (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biología Molecular y Biomedicina por la Universidad de Cantabria
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Biología molecular
      • Proteínas
• Enlaces
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• Resumen
  • español

    1. INTRODUCCIÓN La ruta de señalización RAS/ERK desempeña un papel esencial en el control de la proliferación, diferenciación y supervivencia celular en condiciones fisiológicas. Los fallos en la regulación de dicha ruta contribuyen significativamente a la transformación celular y están incuestionablemente involucrados en la progresión tumoral, además de en otras patologías. De hecho, aproximadamente el 40% del total de los tumores humanos son debidos a la desregulación de la señalización a través de dicha cascada, causada por mutaciones activadoras en las distintas proteínas que la componen. Este porcentaje varía en función del tipo de cáncer, pudiendo alcanzar el 90%. En el caso del melanoma, un 60% de los casos están originados por la desregulación de las señales de ERK. Por estas razones, durante las últimas décadas, esta ruta ha sido el sujeto de intensas investigaciones, con el propósito de identificar componentes susceptibles de ser utilizados como dianas terapéuticas en el tratamiento del cáncer.

    ERK1/2, las quinasas efectoras de esta vía de señalización, se activan en respuesta a diferentes estímulos intra o extracelulares a través de módulos de señalización compuestos por diferentes quinasas citoplásmicas. Las señales de ERK se regulan, entre otros mecanismos, por proteínas de andamiaje o “scaffolds”. Dichas proteínas ensamblan simultáneamente al menos dos componentes de la cascada en un complejo multi-enzimático estable, mediante el cual se regulan la intensidad, amplitud y duración de las señales. Una característica importante de las proteínas scaffold es que la concentración óptima guarda una estricta estequiometría con la concentración de las quinasas que constituyen esta ruta de señalización. Por esta razón, cualquier alteración en sus niveles de expresión tendrá profundas consecuencias en la activación de ERK y, en última instancia, en las respuestas biológicas reguladas por esta ruta. Además, las proteínas scaffold desempeñan un papel central como reguladores espaciales de las señales de ERK. A este respecto, dependiendo de la localización subcelular de la que emanan las señales de RAS, determinados scaffolds especifican qué sustratos son susceptibles de ser fosforilados/activados por ERK.

    Debido a la importancia de las proteínas scaffold en la regulación de esta cascada de señalización, se ha especulado con su posible implicación en la aparición de resistencia a terapias y con su potencial como dianas antitumorales. Una proteína scaffold con presunta capacidad como diana antineoplásica es IQGAP, ya que una cantidad significativa de melanomas exhiben considerables alteraciones en sus niveles de expresión. Por otro lado, la proteína KSR1 destaca como diana terapéutica debido a su inherente participación en la tumorogénesis mediada por RAS oncogénico. En consecuencia, recientemente se ha desarrollado el primer inhibidor de KSR, APS-2- 79, que a la vez es también la primera molécula dirigida contra una proteína scaffold. Sin embargo, esta molécula, a pesar de estabilizar a KSR en su estado inactivo e impedir la activación de MEK dependiente de este scaffold, presenta efectos inhibitorios más bien modestos tanto en la supervivencia celular como en la activación de ERK mediada por KSR.

    Una posible explicación a este fenómeno podría surgir de la interacción directa entre proteínas scaffold. A pesar de las funciones específicas y de regulación de ERK dependiente de la sublocalización de cada scaffold, se ha descrito que algunas de estas proteínas pueden asociarse entre sí. Por ello, hemos considerado la hipótesis de que estos macro-complejos scaffold-scaffold podrían constituir un nivel adicional de regulación para las señales de ERK y servir como nodos de integración para señales en respuesta a estímulos y para la diversificación subsiguiente de respuestas celulares específicas, en función de la afinidad por ERK que exhiben las distintas proteínas scaffold. Entender el mecanismo de regulación de ERK que supondría la coordinación entre proteínas scaffold podría facilitarnos nuevos medios para manipular las señales aberrantes de ERK con fines terapéuticos.

    2. OBJETIVOS Los objetivos planteados en esta tesis son: - Evaluar APS-2-79 como inhibidor de la fosforilación/activación de ERK mediada por KSR y sus consecuencias biológicas.

    - Investigar si las interacciones de KSR con otra/s proteína/s scaffold son la razón de la ineficacia de APS-2-79 en el bloqueo de las señales mediadas por KSR.

    - Investigar si las diferentes proteínas scaffold exhiben diferentes afinidades por ERK.

    3. MATERIALES Y MÉTODOS Para evaluar el efecto apoptótico de la sobreexpresión de KSR o del tratamiento de líneas BRAF y NRAS mutantes de melanoma con APS-2-79 y compararlo con el tratamiento con PLX4032 o con la depleción de KSR se realizó un ensayo de detección de Anexina V mediante citometría de flujo.

    Para estudiar el mecanismo de interacción de KSR1 con ERK fosforilado/activo se utilizaron mutantes incapaces de unirse a ERK (KSR1 ASAP), a MEK (KSR1 C809Y), deficientes para la homodimerización (KSR1 R615H) y se generó por mutagénesis dirigida una proteína KSR1 doble mutante, incompetente para la interacción con MEK y la homodimerización (KSR1 R615H/C809Y). La interacción entre estas construcciones y ERK activo se analizó, de forma directa, mediante ensayos de co-inmunoprecipitación y ensayos de ligación por proximidad (PLA) mediante microscopía de fluorescencia; o, de forma indirecta, mediante ensayos de activación de fosfolipasa A2 citosólica por ERK dependiente de KSR1, a partir de cuantificación de ácido araquidónico tritiado liberado al medio extracelular.

    Se generaron líneas estables de MEFs KSR1 -/- expresando las construcciones mutantes de KSR1 previamente mencionadas donde se analizó el efecto del silenciamento de IQGAP1 sobre la activación de ERK dependiente de KSR y se valoró la capacidad de proliferación mediante contaje de células con la cámara de Neubauer.

    La capacidad proliferativa de líneas representativas de melanoma BRAF o NRAS mutante tras el silenciamiento mediante siRNA contra las proteínas scaffold KSR1 e IQGAP1 fue evaluada a partir del análisis de la actividad metabólica a través de la técnica del Alamar Blue.

    Con el fin de determinar la afinidad entre proteínas scaffold y ERK, se calcularon las constantes de disociación (Kd) a partir de la purificación de MP1, KSR1 (dominio de unión a ERK) e IQGAP1 (dominio WW de unión a ERK) fusionadas con GST con ERK2 generado in vitro marcado radioactivamente en metionina con 35S.

    4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Observamos que el inhibidor de KSR APS-2-79 no mostró efectos en la supervivencia celular a pesar de bloquear la heterodimerización RAF-KSR, impidiendo así el cambio conformacional que esta interacción provoca en KSR exponiendo los sitios de activación de MEK unido a KSR. Con el objetivo de dilucidar si este resultado se correlaciona con la función de KSR, se silenció KSR en una línea de melanoma BRAF mutante y en otra NRAS mutante, y se observó que en esta última el silenciamiento tiene un claro efecto apoptótico, mientras que la inhibición de KSR no lo reflejaba. Por otro lado, se comparó el efecto del APS-2-79 con la depleción de KSR sobre los niveles totales de ERK activo en células HEK293T donde se advirtió que el efecto inhibitorio de la activación de ERK era significativamente mayor en respuesta a la depleción que a la inhibición de KSR. Asimismo, no se apreció disminución en los niveles de fosforilación de ERK dependiente de KSR originada por el inhibidor.

    El hecho de que la inhibición de KSR por APS-2-79 y su depleción no tengan el mismo efecto sobre la activación de ERK y sobre sus respuestas biológicas nos llevó a analizar más en profundidad la regulación de ERK mediada por KSR. En el curso de estos experimentos observamos que una proteína KSR1 mutante incapaz de unir MEK (KSR1 C809Y) se comportaba de la misma manera que la proteína WT en cuanto a la activación de ERK y sus efectos apoptóticos en células de melanoma NRAS mutante (SKMEL2) y en células no tumorales (HEK293T). A consecuencia de este resultado inesperado, se observó que el mutante deficiente para la unión de MEK se comporta como el WT debido a que mantiene la capacidad de unirse a ERK activo. A este respecto, nuestra hipótesis de asociación entre scaffolds y/o la descrita homodimerización de KSR, y la consiguiente interacción entre sus quinasas, podría ofrecer una explicación, pero no era descartable que MEK libre en el citoplasma pudiera ser el responsable de esta fosforilación. Por ello se generó un KSR1 doble mutante deficiente para la homodimerización y la interacción con MEK. En células HEK293T dicho mutante perdía su capacidad de unirse a ERK fosforilado, lo que invalidaba la posibilidad de que MEK libre fuera el causante de la activación de ERK unido a KSR. Con la finalidad de explicar este fenómeno, se descubrió que el scaffold IQGAP1 se unía a KSR. De esta manera, se vio que la sobreexpresión de IQGAP1 rescataba la activación de ERK mediada por el KSR doble mutante, lo que claramente apuntaba a la existencia de transactivación entre las quinasas unidas a scaffolds capaces de asociarse. Hemos denominado este nuevo mecanismo transfosforilación.

    Hemos estudiado con más detalle la interacción entre estas dos proteínas scaffold, como resultado hemos delimitado la región C-terminal de IQGAP1 como la parte de la proteína capaz de unirse a KSR. Por su parte, en KSR1 el motivo de interacción con IQGAP1 está definido entre los residuos 402 y 521.

    En relación a estos resultados, hemos visto que un mutante de IQGAP1 deficiente para unir MEK (IQGAP1 DIQ), al igual que KSR1 C809Y, mantiene la capacidad de incorporar ERK activo. Estos resultados apuntan a la posibilidad de que la transfosforilación sea recíproca entre scaffolds asociados, pero aún necesitamos experimentación adicional para confirmar que es KSR1 y no otro scaffold el responsable de esta transfosforilación.

    En cualquier caso, la cooperación entre scaffolds podría implicar beneficios en el flujo de la señalización de ERK en situaciones en las cuales la concentración de alguna de las quinasas de la ruta sea limitante. En este caso se favorecería la activación del pool de sustratos fosforilados por ERK unido a ese scaffold hacia el que muestre mayor afinidad. En este contexto, las diferencias en la afinidad por ERK mostradas por los distintos scaffolds tendrían un papel importante. Con este fin, se han analizado las constantes de disociación de ERK2 con las proteínas scaffold MP1, KSR1 e IQGAP1, siendo MP1 el de mayor e IQGAP1 el de menor afinidad. Estas diferencias en afinidad están reflejadas en la cinética de interacción con ERK en diferentes condiciones de estimulación.

    En definitiva, considerando a) la capacidad de scaffolds para homodimerizar; b) la posibilidad de que distintos scaffolds heterodimericen y c) las distintas afinidades hacia ERK que muestran distintos tipos de scaffolds, que las señales de ERK se transmitan a través de un scaffold u otro dependería de: 1) la afinidad de homodimerización de cada scaffold; 2) la afinidad de heterodimerización entre distintos scaffolds y, por último, 3) de las constantes de disociación de cada scaffold hacia ERK.

    5. CONCLUSIONES - APS-2-79 es ineficaz como inhibidor de la oncogénesis inducida por la ruta RAS/ERK. Posiblemente como consecuencia de su incapacidad para interferir en la fosforilación de ERK dependiente de KSR.

    - Las proteínas scaffold KSR1 e IQGAP1 deficientes para unir MEK pueden incorporar ERK fosforilado a través de transfosforilación.

    - En el caso de KSR1, la transfosforilación es llevada a cabo, no por MEK libre, sino por MEK unido a la otra molécula de KSR que forma el homodímero o a una molécula de IQGAP1 formando un herodímero.

    - KSR1 se une a IQGAP1. Tal interacción ocurre a través de la región CA4 de KSR1 y de la región C-terminal de IQGAP1, y es altamente dependiente de la estequiometría entre KSR1 e IQGAP1.

    - La ineficiencia de APS-2-79 para inhibir la fosforilación de ERK unido a KSR es una consecuencia de su incapacidad para prevenir la transfosforilación, probablemente porque este inhibidor no puede interferir en la interacción entre KSR1 e IQGAP1.

    - Las proteínas scaffold MP1, KSR1 e IQGAP1 exhiben diferentes afinidades por ERK. Estas diferencias dictan la cinética de interacción de ERK con los distintos scaffolds en respuesta a estimulación.

  • English

    The Ras/ERK pathway is noticeably linked to the development and progression of human malignancies. About 40% of human cancers harbor activating mutations in constituents of this pathway. One of the regulatory mechanisms is carried out by scaffold proteins, that modulate the intensity, amplitude and duration of ERK signals. For this reason, some scaffolds harbor a potential as antitumoral targets. In light of recent evidence unveiling direct interactions among different scaffold proteins species, we have considered the hypothesis that scaffold proteins must somehow interact with each other in order to regulate the flow of signals through the Ras/ERK pathway in a coordinated manner. This could be a possible explanation for the inefficacy of a novel small molecule KSR inhibitor. Indeed, we have shown that KSR1 and IQGAP1 mutants defective for binding MEK, can still associate to phosphorylated ERK. In this respect, we have found that KSR1 and IQGAP1 can directly interact among themselves, and in so doing they can “transphosphorylate” each other, enabling ERK phosphorylation in MEK-binding deficient mutants. Thus, associations among different scaffold proteins will add one further degree of regulation for an already tightly regulated cascade and could provide a novel means for manipulating ERK signals even with therapeutic purposes.