Modulación del canal iónico trpa1 por la chaperona sigma 1: papel en la neuropatía periférica inducida por oxaliplatino

• Autores: Aida Marcotti
• Directores de la Tesis: Félix Viana de la Iglesia (dir. tes.), Elvira de la Peña García (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Miguel Hernández de Elche ( España ) en 2020
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Teresa Pérez García (presid.), Salvador Sala Pla (secret.), Carolina Laura Roza Fernández de Caleya (voc.), Xavier Gasull Casanova (voc.), Rodolfo Madrid Montecinos (voc.)
• Programa de doctorado: Programa Oficial de Doctorado en Neurociencias
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• Resumen

  • El canal iónico TRP Anquirina 1 (TRPA1) es un canal catiónico polimodal que juega un papel crítico en la quimionocicepción, como sensor molecular de irritantes reactivos, estrés y daño tisular. En mamíferos, TRPA1 también ha sido considerado como un sensor de frío nocivo y de estímulos mecánicos, aunque esto aún es debatido. En el contexto del dolor neuropático, se ha demostrado, en modelos animales murinos, que el canal TRPA1 tiene un papel prominente en la hipersensibilidad al frío y la alodinia mecánica observada durante la neuropatía inducida por quimioterapia. Por otro lado, sigma 1 (σ1) es una chaperona ubicada principalmente en las membranas del retículo endoplásmico asociadas a mitocondrias (MAM) y que se encuentra ampliamente distribuida en diversos tejidos del organismo, incluyendo su expresión en las neuronas sensoriales primarias. Sigma 1 actúa como un modulador de la excitabilidad, regulando la función y el tráfico de diferentes canales iónicos de la membrana plasmática, así como en la homeostasis de la concentración del calcio intracelular. El tratamiento con S1RA, un antagonista selectivo de σ1, tiene efectos antinociceptivos en modelos animales de dolor neuropático. Sin embargo, el mecanismo molecular de estos efectos se desconoce.

    El objetivo de esta tesis ha sido estudiar la posible modulación del canal TRPA1 por σ1 en un modelo de neuropatía inducida por administración sistémica de oxaliplatino en ratones. Para explorar esta hipótesis, hemos utilizado una combinación de diferentes enfoques: evaluación de moduladores de σ1 en pruebas de comportamiento, técnicas de imagen de calcio y registros electrofisiológicos en sistemas de expresión heteróloga y en neuronas sensoriales primarias disociadas de los ganglios raquídeos (DRG), así como técnicas de biología molecular y bioquímicas. En las pruebas de comportamiento, encontramos que los ratones silvestres tratados con oxaliplatino desarrollaron alodinia mecánica e hipersensibilidad al frío. Cuando los ganglios raquídeos de estos ratones fueron disociados y estudiados con imagen de calcio in vitro, las neuronas sensoriales mostraron mayores respuestas a AITC (agonista selectivo de TRPA1). También se observó un incremento en el número de neuronas que respondían a estímulos de frío, aunque este incremento no parece estar asociado a las neuronas que expresan TRPA1. Además, se observó, en contra de lo esperado, una disminución en el umbral promedio de detección de la temperatura. En contraste, los ratones TRPA1-/- tratados con oxaliplatino no mostraron hipersensibilidad al frío y desarrollaron menos alodinia mecánica en comparación con los ratones silvestres. En condiciones in vitro, las neuronas sensoriales obtenidas de ratones TRPA1-/- mostraron un incremento en el número de neuronas que respondían a frío, menor que en los ratones silvestres. En su conjunto, estos resultados sugieren que el tratamiento con oxaliplatino modifica la actividad del canal TRPA1 y también la de otros canales iónicos sensores de frío.

    Además, encontramos que el comportamiento aversivo de los ratones en respuesta a AITC se vio disminuido por el antagonismo de σ1 con S1RA. En concreto, los ratones tratados con una inyección intraperitoneal de S1RA mostraron una disminución en las respuestas nocifencivas a la inyección intraplantar de AITC, sugiriendo una posible modulación in vivo del canal TRPA1 por σ1.

    Debido a que la quimioterapia es un proceso planificado, implementamos un tratamiento simultáneo con S1RA y oxaliplatino para evaluar el posible efecto preventivo del S1RA en el desarrollo de la neuropatía. Los ratones silvestres tratados simultáneamente con S1RA y oxaliplatino desarrollaron menor alodinia mecánica e hipersensibilidad al frío que los tratados únicamente con oxaliplatino. Las neuronas sensoriales obtenidas de estos ratones mostraron una menor amplitud en las respuestas de calcio intracelular al estímulo de AITC, lo que sugiere una inhibición de la actividad de TRPA1 por el tratamiento con S1RA. Además, los cambios en las respuestas a frío en condiciones in vitro, en neuronas previamente tratadas con oxaliplatino, fueron restablecidos a condiciones basales con la administración de S1RA.

    La medición de los cambios intracelulares de calcio en células HEK293-hTRPA1 incubadas con S1RA a diferentes concentraciones mostraron una disminución dosis dependiente en la respuesta provocada por diferentes tipos de agonistas de TRPA1 (AITC y carvacrol). Las corrientes de membrana en respuesta a AITC, en células HEK293-hTRPA1, también se redujeron después de la incubación con S1RA. S1RA no indujo cambios en la actividad de TRPA1 en una línea celular donde σ1 se encuentra silenciado (HEK293-σ1KO), lo que sugiere una modulación directa de TRPA1 por σ1. Los resultados bioquímicos de inmunoprecipitación sugirieron la formación de un complejo entre TRPA1 y σ1 cuando éstos fueron expresados en células HEK293. Debido a los déficits funcionales observados tras la incubación con S1RA, ésta podría producir una alteración en el tráfico, así como en el plegamiento y la estructura final del canal TRPA1.

    En resumen, estos resultados muestran que la chaperona σ1 modula la actividad del canal TRPA1 (humano y de ratón) y que el uso del antagonista de σ1, S1RA, atenúa los síntomas neuropáticos consecuencia del tratamiento por oxaliplatino, pudiendo utilizarse como una estrategia analgésica preventiva. Además, los resultados obtenidos sugieren que tanto la neuropatía inducida por oxaliplatino como los efectos de S1RA no solo afectan a la población de canales TRPA1.