Resumen de Elucidating the role of Nampt and Parp1 in chronic inflammatory skin diseases

Francisco Javier Martínez Morcillo

• español

  La psoriasis y la dermatitis atópica, o ezcema, son dos enfermedades no contagiosas de inflamación crónica en piel, cuya prevalencia es 0,1-3 % y 2-20 %, respectivamente. Su etiología no ha sido determinada, predispuestos genéticamente, numerosos factores ambientales pueden desencadenar la patología, estando también involucradas causas alérgicas e inmunitarias. Nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) es un importante transportador de hidrógenos en reacciones redox que participa en más de 500 reacciones. NAD+ regula procesos celulares vitales, como el funcionamiento y el metabolismo mitocondrial, reacciones redox, respuesta inmunitaria e inflamación y daño en ADN, entre otras. NAMPT, la enzima limitante de la ruta de salvamento de NAD+, ha sido asociada a estrés oxidativo e identificada como un biomarcador universal de inflamación crónica, incluyendo psoriasis. Experimentos con líneas transgénicas de pez cebra que permiten el seguimiento de células inmunitarias y actividad transcripcional de NF B, nos permitió demostrar que NAD+ y sus precursores regulan la liberación de H2O2 por los queratinocitos y la inflamación en piel. Consecuentemente, la inhibición farmacológica de Nampt por FK-866, que induce depleción de NAD+, contrarrestó la síntesis de H2O2 por los queratinocitos. Utilizando como modelo de psoriasis el mutante spint1a, se encontró que presentan una mayor producción de H2O2 en la piel y daño en ADN. En este modelo, FK-866 redujo la síntesis de H2O2, la inflamación en piel, la dispersión de neutrófilos, la proliferación de queratinocitos y el daño en ADN, restaurando así la integridad epitelial, lo que se revirtió por NAD+. La depleción de NAD+ debe tener un impacto en la actividad enzimática de enzimas que dependen de NAD+ como cofactor. En este trabajo, se utilizaron varios inhibidores específicos de estas enzimas, demostrando que la inhibición de Parp1 por olaparib, veliparib o talazoparib, mostraba los mismos efectos que FK-866. Tanto FK-866 como olaparib restauraron la integridad epitelial en el mutante de la subunidad ?1a de la ATPasa transportadora de Na+/K+ (atp1b1a). En los mutantes spint1a, olaparib indujo daño en ADN y redujo la muerte celular y la PARilación. Llamativamente, los compuestos eliminadores de ROS también funcionaron. Este resultado junto con el mayor daño en ADN nos condujo a hipotetizar que parthanatos, una muerte celular dependiente de PARP1 tras un importante daño en ADN, ocurría en los agregados cutáneos. De acuerdo con la hipótesis, un inhibidor de la traslocación de AIFM1 de la mitocondria al núcleo, un paso fundamenta en parthanatos, mostró los mismos resultados que la inhibición de Nampt y Parp1 en los mutantes spint1a.

  En datos transcriptómicos de humano comparando piel sana y de pacientes psoriáticos o dermatitis atópica, encontramos un perfil de expresión alterado en genes que codifican enzimas clave en las rutas de NAD+ de salvamento, Preiss-Handler y de novo en tejidos lesionados en comparación con tejidos sin lesión o sanos. De forma similar, encontramos un perfil de expresión alterado en genes que codifican enzimas implicadas en el metabolismo de PAR y parthanatos. El perfil de expresión de genes involucrados en el metabolismo de NAD+, PAR y parthanatos correlacionan con genes marcadores inflamatorios de cada enfermedad, de acuerdo con su respuesta de linfocitos TH. Adicionalmente, análisis en HPLC-MS de suero de pacientes de psoriasis indicaron que los respondedores a fototerapia (PUVA) presentaban menores niveles de NAD+, relación NAD+/NADH y SAM antes del tratamiento que se normalizaban tras este, pudiendo ser potencialmente utilizado como biomarcadores séricos para predecir la respuesta a la fototerapia. Finalmente, confirmamos una acumulación a nivel proteico de Nampt y PAR en el núcleo de queratinocitos en lesiones psoriáticas. Colectivamente, el metabolismo de NAD+ y PAR podrían representar nuevas dianas terapéuticas para la psoriasis y probablemente otras enfermedades de inflamación crónica en piel.

• English

  Psoriasis and atopic dermatitis, or eczema, are two non-contagious skin chronic inflammatory diseases, which global prevalence is 0.1-3 % and 2-20 %, respectively. The aetiology is still undetermined, even though both diseases have a genetic predisposition, numerous environmental factors act as triggers of the pathology, being allergic and immunological causes also involved. Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) being the most important hydrogen carrier in redox reactions in the cell, is a pleiotropic molecule participating in over 500 reactions. NAD+ regulates vital cellular processes such as mitochondrial function and metabolism, redox reactions, immune response, inflammation and DNA repair, among others. NAMPT, the rate-limiting step enzyme in the NAD+ salvage pathway, has been associated to oxidative stress and inflammation, being identified as a universal biomarker of chronic inflammation, including psoriasis. Experiments with transgenic zebrafish lines that enable in vivo immune cell-tracking and NF B transcriptional activity monitoring, let us to demonstrate that NAD+ and its precursors critically regulated H2O2 keratinocyte release and skin inflammation. Consistently, pharmacological inhibition of Nampt by FK-866, that induces NAD+ depletion, efficiently counteracted H2O2 synthesis by keratinocytes in wild type animals. By using psoriasis model spint1a mutant, we found that Spint1a-deficient zebrafish exhibited increased skin H2O2 production and DNA damage. In this model, FK-866 reduced H2O2 production by keratinocytes, skin inflammation, neutrophil infiltration, keratinocyte proliferation and DNA damage, collectively restoring epithelial integrity. Notably, all these effects could be reversed by exogenous supplementation of NAD+. As NAD+ depletion mediated by FK-866 must have an impact on the enzymatic activity of enzymes that depend on NAD+ as a cofactor, in this work several specific inhibitors of various enzymes that consume NAD+ were used. Inhibition of the enzymatic activity of Parp1 by olaparib, veliparib or talazoparib, recapitulated the effects of FK-866. Both FK-866 and olaparib were also able to restore epithelial integrity in another zebrafish model of psoriasis, the ATPase Na+/K+ transporting subunit ?1a (atp1b1a) mutant. In Spint1a-deficient zebrafish, olaparib treatment additionally induced DNA damage while reduced cell death and PARylation. Strikingly, ROS scavengers were also able to rescue spint1a mutant phenotype. This fact together with increased number of DNA lesions in mutant embryos, led us to hypothesized parthanatos, a PARP1 dependent cell death upon extensive DNA damage, as the programmed cell death occurring in dermal aggregates. In agreement with our hypothesis, an inhibitor of AIFM1 translocation from mitochondria to nucleus, a critical step in parthanatos mechanism, also recapitulated the effects of Nampt and Parp1 inhibition in Spint1a-deficient animals.

  In human transcriptomic data comparing skin from healthy subjects and psoriasis or atopic dermatitis patients, we found an altered expression profile of genes encoding key enzymes involved in NAD+ salvage pathway, Preiss-Handler pathway and de novo pathway in lesional compared with non-lesional or healthy samples. In a similar way, we found an altered expression profile of genes encoding enzymes involved in PAR metabolism and parthanatos. The expression profile of genes involved in NAD+ and PAR metabolism and parthanatos correlated with inflammatory gene markers of each disease, according to specific cytokines implicated in their TH lymphocyte responses. Additionally, HPLC-MS analysis of serum samples of psoriasis patients indicated that responders to phototherapy (PUVA) exhibited reduced levels of NAD+, NAD+/NADH ratio and SAM before the treatment that were normalized to control group after the treatment, potentially being useful as serum biomarkers to predict the response of psoriasis patients to phototherapy. Finally, we observed increased expression of NAMPT at protein level and PAR accumulation in the nucleus of epidermal keratinocytes from psoriatic lesions. Collectively, our results point out to NAD+ and PAR metabolism as new potential therapeutic targets to treat psoriasis and probably other skin chronic inflammatory diseases.