Resumen de Influencia del procesamiento de la leche humana donada sobre la microbiota intestinal, la expresión genómica y el equilibrio oxidativo en recién nacidos pretérmino menores de 32 semanas de edad gestacional
INTRODUCCIÓN A nivel mundial, 15 millones de bebés nacen prematuros cada año, lo que se estima en aproximadamente el 11% de todos los partos, con tendencia al aumento en la mayoría de los países.
El período neonatal es un período de vida excepcionalmente vulnerable durante el cual los recién nacidos a término (RNT) pero especialmente los prematuros tienen, comparado con otras etapas de la vida, un mayor riesgo de mortalidad y morbilidad que puede conducir a secuelas neurocognitivas, motoras y sensoriales permanentes, constituyendo así un grave problema de salud económico y social.
La prematuridad causa anualmente alrededor de 1 millón de muertes en todo el mundo. Aunque las muertes neonatales en recién nacidos prematuros han disminuido en los últimos 20 años, especialmente en países con elevado índice de desarrollo, continúa siendo la principal causa mundial de mortalidad neonatal y recientemente también en la principal causa de mortalidad infantil en niños menores de cinco años.
Los primeros 1,000 días de vida se consideran un período esencial debido a las altas necesidades de energía y nutrientes asociadas con el rápido crecimiento y desarrollo observado durante los períodos prenatal y postnatal. Este es también un período crítico en el desarrollo metabólico, inmunológico, cognitivo y educativo. Una colonización microbiana adecuada durante este periodo es fundamental para la maduración apropiada del sistema inmune, el metabolismo así como el desarrollo del sistema nervioso central, favoreciendo la maduración de funciones cognitivas y sensoriales, como la visión. Las alteraciones de la microbiota pueden tener consecuencias importantes para la salud.
La colonización microbiana en el periodo neonatal se ve afectada por la edad gestacional, el tratamiento con antibióticos, el tipo de nacimiento, y también por el tipo de alimentación.
La leche materna (LM) ha sido reconocida como el estándar de oro para la nutrición humana.
Más allá de los componentes nutricionales, que se adaptan perfectamente a los requerimientos de los lactante, la LM es un fluido complejo y vivo, que contiene compuestos bioactivos importantes como oligosacáridos (prebióticos), carbohidratos, citocinas, células inmunes, lisozima, lactoferrina, inmunoglobulinas, microorganismos (probióticos), ácidos grasos y proteínas, entre otros, que influyen directamente en el desarrollo del bebé e inducen una colonización de microbiota intestinal.
Esos compuestos bioactivos se consideran no solo protectores sino que también estimulan el crecimiento y neurodesarrollo junto con la maduración del sistema inmune inmaduro. A su vez, modulan las condiciones metabólicas e inflamatorias en la infancia tardía y la edad adulta, en especial cuando el individuo tiene contacto con ellos durante los primeros meses de vida. Su exposición temprana reduce el riesgo de desarrollar ciertas enfermedades como enfermedades inflamatorias intestinales, infecciones gastrointestinales, respiratorias, alergia, etc. Además, las prácticas de lactancia materna se han asociado con una reducción del riesgo de Sepsis Tardía y ECN, en los recién nacidos prematuros. Particularmente para ésta última, cualquier volumen de LM es mejor que leche de fórmula de prematuro (FP), y cuanto mayor sea la dosis, mayor será la protección.
Por otra parte, el oxígeno es uno de los componentes más críticos de la vida.
Lograr el equilibrio perfecto entre protección y letalidad es un proceso complejo.
El papel del oxígeno en el metabolismo energético es ser un aceptor de electrones en la cadena respiratoria. Al aceptar cuatro electrones, se reduce a agua, pero una pequeña parte del oxígeno requiere cuatro pasos para que este proceso se complete. Cada paso intermedio se produce dentro de las mitocondrias y genera especies reactivas de oxígeno (ROS), incluido el radical superóxido (O2−), el peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical hidroxilo (OH). Los radicales superóxido e hidroxilo son radicales libres y, por lo tanto, altamente tóxicos y tienen la capacidad de destruir las membranas celulares mediante la peroxidación lipídica, las proteínas estructurales y enzimáticas y la oxidación del ADN. Los radicales libres pueden interferir con el plegamiento y el despliegue de proteínas, lo que conduce a una función o estructura anormal.
La transición fetal-neonatal el RN supone un estrés oxidativo “fisiológico”.
Los RNT cuentan con un sistema de defensa antioxidante que les protegerá frente al aumento en la producción de radicales libres de oxígeno (ROS) y de nitrógeno (RNS). Sin embargo, los recién nacidos prematuros tienen un sistema de defensa antioxidante inmaduro. La estabilización de los mismos en la sala de partos a menudo requiere la administración de ventilación con presión positiva y suplementos de oxígeno, lo que conduce a la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y al estrés oxidativo (EO).
Lo mismo ocurre con otros tratamientos administrados como la fototerapia, la nutrición parenteral, la ventilación mecánica o los antibióticos, entre otros. Todo esto conduce a una producción elevada de ROS/RNS y a niveles de estrés oxidativo fisiopatológico con graves daños oxidativos a macromoléculas, que contribuyen al desarrollo de complicaciones graves, mediadas por estos marcadores inflamatorios, como la DBP, la ROP o la HIV, hipertensión pulmonar persistente (HTP), enterocolitis necrotizante (ECN), entre otras.
La LM, a su vez, proporciona protección antioxidante (con antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos) y, por lo tanto, los recién nacidos prematuros alimentados con leche humana presentan niveles más bajos de biomarcadores relacionados con el estrés oxidativo que los alimentados con fórmula.
Hay cada vez más evidencia de que la nutrición desempeña un papel importante en la regulación del desarrollo y la función intestinal neonatal.. Las funciones detalladas de las moléculas bioactivas específicas de la leche, y los diferentes tipos de leches (LM y LF), modulan el sistema inmunológico del recién nacido. La regulación génica es diferente según el tipo de alimentación.
Se ha visto que a nivel de calostro bovino un estudio demostró que puede proteger y preservar la integridad de la barrera de la mucosa intestinal en el hospedador controlando los niveles de expresión de genes inflamatorios tempranos y tardíos después de la invasión de patógenos entéricos. En células expuestas a la LM desnatada, se encontraron diecisiete genes expresados diferencialmente, la mayoría de ellos regulados positivamente, incluidos cuatro genes de quimiocinas (CXCL1, CXCL2, CXCL3 y CXCL10) y otros genes relacionados con la inmunidad.
La leche humana donada (LHD) pasteurizada es la mejor alternativa en los prematuros menores de 32 semanas de edad gestacional, menores de 1500 gramos, cuando la leche de la propia madre (LM) no está disponible.
Los beneficios demostrados de alimentar a los recién nacidos con LHD frente a las fórmulas artificiales son a corto plazo: su protección frente a la enterocolitis necrotizante la infección nosocomial y mejor tolerancia enteral. Algunos artículos afirman que también protege contra la displasia broncopulmonar. Y a largo plazo, presentan un mejor neurodesarrollo que aquellos alimentados con fórmula y un menor riesgo cardiovascular durante la adolescencia (cifras menores de tensión arterial y mejor perfil de lipoproteínas con menor riesgo de sufrir arterioesclerosis).
La leche humana donada ha de procesarse para garantizar su seguridad microbiológica cuyo objetivo es eliminar las bacterias contaminantes y asegurar la ausencia de virus.
El tratamiento térmico utilizado por la mayoría de los Bancos de Leche, para inactivar los agentes virales y bacterianos es la pasteurización mediante el método Holder, el cual se caracteriza por someter a la leche materna a una temperatura de 62.5°C durante 30 minutos para después enfriarla rápidamente en menos de 15 minutos hasta 4 ºC.
La pasteurización causa la pérdida de algunas de las propiedades biológicas, estructurales y funcionales de la LM ya que favorece la destrucción celular (incluidos linfocitos B y T) y bacteriana, así como la alteración parcial o total de la estructura y función de algunos de sus componentes. Por todo ello, se están diseñando nuevas técnicas de pasteurización que minimicen el impacto sobre los componentes de la leche, como el método Hight Temperature Short Time (HTST) o el procesamiento a alta presión (HPP).
Sin embargo, poco se sabe sobre el efecto de la LHD sobre la microbiota intestinal en prematuros y las posibles implicaciones biológicas, sobre si protege frente al estrés oxidativo y qué cambios produce sobre la expresión genómica en células intestinales exfoliadas.
OBJETIVOS: Nuestro objetivo fue determinar el impacto de la LHD sobre la microbiota intestinal, el estrés oxidativo en orina y la expresión genómica en células intestinales epiteliales exfoliadas (CIEE), en recién nacidos prematuros ingresados en una unidad de cuidados intensivos neonatales de referencia.
POBLACIÓN Y MÉTODOS: Se realizó un estudio de cohortes, prospectivo, observacional y unicéntrico dónde se incluyen, durante un periodo de 12 meses, todos los recién nacidos ≤ 32 semanas de edad gestacional, ≤ 1500 gramos, ingresados en la Unidad de Neonatología del Hospital Universitario y Politécnico La Fe (Valencia, España), Se recogieron muestras fecales y de orina de 69 prematuros, cuando se consiguió la alimentación enteral completa (definida como ≥150 cc / kg / día) con LM, LHD o fórmula de prematuro (FP).
Según los protocolos de la Unidad Neonatal, se intentó la alimentación completa con LM en todos los casos, pero no se logró en todos los pacientes. Se reclutaron dos grupos de pacientes, según el tipo de alimentación principal, siendo ≥80% de la ingesta nutricional con LM o LHM. Cuando fue necesario, se proporcionó LHM u LM respectivamente para completar el volumen total. Un tercer grupo en que los padres rechazaron la alimentación del prematuro con LM o LHD, fue alimentado con FP.
Los recién nacidos prematuros fueron alimentados al ingreso en la Unidad, con pequeños volúmenes de nutrición enteral trófica (entre 15-30 ml / kg / día), que se incrementó progresivamente hasta alcanzar la nutrición enteral completa en los días 10-12 después del nacimiento. La nutrición se complementó con nutrición parenteral intravenosa, que se fue disminuyendo de forma gradual, acorde al aumento de nutrición enteral, hasta su retirada.
La ingesta diaria se proporcionó con LM o LHD para lograr el volumen de alimentación prescrito. Los pacientes del grupo LHD solo recibieron leche de un donante. La ingesta nutricional se controló, pero nunca fue influenciada por este estudio observacional.
No se encontraron diferencias en las características demográficas prenatales ni factores de confusión durante la hospitalización entre los tres grupos por lo que las poblaciones fueron comparables en los 3 estudios.
El estudio fue aprobado por el comité científico para la investigación biomedical (CEIm) (#2015/0317) del Hospital Universitario y Politécnico La Fe. Todos los padres aceptaron y firmaron el consentimiento informado.
La composición de la microbiota intestinal se analizó mediante secuenciación del gen de ARNr 16S. El ADN fecal total se aisló usando el Kit de purificación de ADN y ARN completo MasterPure (Epicenter, Madison, WI, EE. UU.). De acuerdo con las instrucciones del fabricante con modificaciones que incluyeron un paso de disruptor y la incubación de enzimas para aumentar la extracción de ADN como se describe en otras partes (31). La concentración total de ADN se midió usando un fluorómetro Qubit® 2.0 (Life Technology, Carlsbad, CA, EE. UU.) Y se normalizó a 5 ng / μL para la amplificación del gen 16 S de ADNr (región V3-V4) usando el kit Nextera XT Index. Los amplicones se verificaron con un chip Bioanalyzer DNA 1000 y las bibliotecas se secuenciaron usando un ciclo de 2x300pb emparejado (MiSeq Reagent kit v3) en una plataforma MiSeq-Illumina (servicio de secuenciación FISABIO, Valencia, España). Los controles durante la extracción de ADN y la amplificación por PCR también se incluyeron y secuenciaron.
Los datos se obtuvieron usando RStatistics (r Core Team, 2012) (32) y el procesamiento de datos se realizó usando QIIME (versión 1.9.0) (Coaporaso et al. 2010).
La determinación de biomarcadores de daño oxidativo al ADN y a las proteínas en muestras de orina de RNPT, así cómo los biomarcadores de peroxidación lipídica mediados por radicales libres individuales, se realizó siguiendo un método de cromatografía líquida Ultra Performance previamente validado - espectrometría de masas en tándem (UPLC-MS / MS). Las muestras se analizaron empleando un sistema Acquity-Xevo TQ de Waters (Milford, MA, EE. UU.). Los datos de LC-MS / MS se adquirieron y procesaron utilizando MassLynx 4.1 y QuanLynx 4.1 (Waters, Milford, MA, EE. UU.), Respectivamente. Las concentraciones de biomarcadores que se encuentran por debajo del LOQ fueron reemplazadas por 0.5xLOQ antes del análisis de datos. El análisis de datos se realizó en Matlab 2017a de The Mathworks (Natick, MA, EE. UU.) Y SPSS 17.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, EE. UU.).
El ARN total de CIEE se procesó para el análisis de expresión de todo el genoma.
El ARN total se aisló directamente de las muestras fecales utilizando el reactivo Trizol (TRIzol, Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Carlsbad, CA, EE. UU.), Seguido de un paso de enriquecimiento de ARN poliA + para eliminar el ADN contaminante y el ARN bacteriano utilizando SOLAMENTE el ARNm ™ Kit de aislamiento de ARNm eucariótico (Epicenter Analytics Inc., Etobicoke, ON, Canadá) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El número de integridad del ARN (RIN) se probó empleando el bioanalizador 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.), Y la concentración y pureza del ARN se determinaron utilizando un espectrofotómetro (GeneQuant, GE Healthcare Biosciences, alemán, Europa). La relación 260/280 y la integridad del ARN entre ambas poblaciones se compararon mediante la prueba T-Student. Los valores de RIN> 6 se consideraron óptimos para la hibridación y fueron estadísticamente similares (valor p = 0,6).
La síntesis de ADNc y ARNc, el marcado, la hibridación y el escaneo de las muestras se realizaron de acuerdo con el Manual del kit de reactivos WT Plus (Thermo Fisher Scientific, Madrid, España). Para preparar el cóctel de hibridación, se usaron 5,5 μg de cRNA biotinilado fragmentado. Posteriormente, este cóctel se hibridó en el micromatriz Clariom S Human durante 16 horas a 45 ° C (Thermo Fisher Scientific, Madrid, España). Este microarray contiene más de 20,000 genes bien anotados. El microarray utilizado es específico solo para el organismo humano.
Los datos sin procesar se importaron a Partek Genomics Suite v6.6 (Partek, Inc., St. Louis, MO, EE. UU.) Como archivos CEL. Los datos sin procesar se preprocesaron, lo que incluyó la corrección de fondo, la normalización y el resumen utilizando un análisis robusto de promedio de múltiples arreglos (RMA) y luego transformados en log2.
RESULTADOS:
A pesar de una mayor variabilidad, no se encontraron diferencias en la diversidad y riqueza microbiana, aunque el tipo de alimentación influyó significativamente en la composición de la microbiota intestinal en los prematuros y en los perfiles funcionales predictivos.
Se encontraron diferencias significativas en la composición de microbiota según el tipo de alimentación. Encontramos una menor abundancia relativa de Firmicutes (30.9 vs 45.5%, p valor = 0.029) y una mayor abundancia de Actinobacterias (20.1 vs 10.2%, valor p = 0.040) en el grupo de LM en comparación con el de LHD.
A nivel de familias, se observó una mayor abundancia de Bifidobacteriaceae (19.5 vs 9.0%, valor p = 0.027) y una menor abundancia de Clostridiaceae (3.7 vs 11.2%, valor p = 0.029) en el grupo de LM, comparado con el de LHD (Figura 1B). A nivel de género, niveles más altos de Bifidobacterium (19.5 vs 8.98%, valor p = 0.027) y Enterobacteriaceae no clasificadas (29.77 vs 18.48%, valor p = 0.060) y niveles más bajos de Citrobacter (2.60 vs 9.83%, valor p = 0.060), y Clostridiaceae sin clasificar (3.46 vs 9.43%, valor p = 0.062) se observaron en muestras fecales de LM en comparación con el grupo de LHD.
A nivel familiar, las muestras de LM estaban más enriquecidas en la familia Bifidobacteriaceae, en comparación con muestras de LHD (LDA = 4.90, valor p = 0.025) mientras que las muestras de LHD estaban más enriquecidas en la familia Staphylococcaceae (LDA = 4.63, valor p ≤0.042) y Pasteurellaceae (LDA = 4.358, valor p = 0.050).
El test DESeq2 se utilizó para identificar abundancias diferenciales de bacterias específicas entre los grupos de alimentación. El Filo Actinobacteria fue mayor en LM en comparación con el grupo LHD (20.07 vs 10.25%, valor p = 0.0044, FDR = 0.013). La abundancia de Staphylococcus (valor p <0.0001, FDR <0.0001), Clostridium (valor p <0.0001, FDR = 0.0013), Serratia (valor p <0.0001, FDR = 0.0022), Coprococcus (valor p = 0.0021, FDR = 0.012), Aggregatibacter (valor p = 0.015, FDR = 0.059) y Lactobacillus (valor p = 0.056, FDR = 0.18) fue significativamente mayor en el grupo de LHD que en el grupo de LM. Sin embargo, Bacteroides (valor p <0.0001, FDR = 0.0044), Acinetobacter (valor p <0.0001, FDR = 0.002) y Haemophilus (valor p = 0.0014, FDR = 0.009) fueron significativamente más altos en aquellos alimentado con LM que en los alimentados con LHD.
El análisis discriminante redundante multivariante basado en las OTU observadas mostró diferencias estadísticamente significativas en la composición microbiana entre los grupos (LM, LHD, FP) (p = 0.001). Se observó una abundancia relativa significativamente mayor de Firmicutes (valor p = 0.027, FDR = 0.016) en el grupo Fórmula en comparación con LM Y LHD. A nivel de género, mayor abundancia significativa de Blautia (p valor <0.001, valor p ajustado = 0.033, FDR = 0.033), estreptococo (p valor = 0.0024, FDR = 0.054), Acidaminococcus (p valor = 0.0093, FDR = 0.099), Rothia ( p valor = 0.0059, FDR = 0.088) y Dorea (p valor = 0.011, FDR = 0.099) se observaron en el grupo Fórmula en comparación con los grupos de LM y LHD.
Los recién nacidos prematuros alimentados con LHD mostraron perfiles microbianos más cercanos a los de aquellos alimentados con LM.
El núcleo central del microbioma intestinal en los prematuros está compuesto por un total de 15 géneros compartidos, independientemente de la dieta de tipo de alimentación. El género Acinetobacter estuvo presente exclusivamente en el grupo de LM; mientras que el género Coprococcus estuvo presente en el grupo de LHD y el género Peptostreptococcaceae no clasificado en el grupo de Fórmula.
La prueba de tamaño del efecto del análisis discriminante lineal mostró que en el grupo de Fórmula había más enriquecimiento de los géneros Rothia, Streptococcus y Acidaminococcus , en comparación con el grupo de LM y LHD, mientras que el grupo de LM estaba más enriquecido con los géneros Bifidobacterium, Acinetobacter y Haemophilus, en comparación con el de LHD, lo que representa un sello distintivo para la microbiota intestinal de los prematuros amamantados.
La predicción metagenómica inferida PICRUSt reveló diferencias significativas en las principales clases funcionales (Enciclopedia de Kyoto de Genes y Genomas, categorías KEGG en el nivel 2), derivadas de adquisiciones funcionales asociadas a diferentes dietas (prueba RDA multivariante, p = 0.007).
Además, no se encontró un perfil metabólico diferente (p valor de la prueba RDA> 0.05) cuando se compararon los prematuros alimentados con LM y LHD, mientras que el perfil funcional del grupo de Fórmula fue significativamente diferente de los observados en el grupo de LM (p valor de la prueba RDA = 0.024) y LHD (prueba RDA, p valor = 0.002).
El ADCP para identificar grupos específicos de actividad funcional (KEGG nivel 2 y 3) del microbioma intestinal en prematuros según el tipo de dieta (Figura 5B) sugiere una actividad KEGG distinta. Las actividades funcionales del microbioma intestinal de los alimentados con LM y LHD son más similares entre ellas que las observadas en el grupo de Fórmula.
Los análisis metagenómicos inferidos mostraron que una mayor presencia del género Bifidobacterium en el grupo de la leche materna estaba relacionada con el enriquecimiento en la vía de biosíntesis y metabolismo de glicanos, cosa que no se identificó en los grupos de prematuros alimentados con LHD o con fórmula.
Por otra parte, la evaluación in vivo no invasiva del estrés oxidativo no mostró diferencias estadísticamente significativas en ninguno de los 22 biomarcadores en orina, entre ambos grupos (LM vs LHD) en el momento en que se consiguió la nutrición enteral completa (150 ml / kg / día).
Además, se evaluaron los cambios de los niveles de biomarcadores en orina con el tiempo: 1, 2 o 3 semanas después (hasta el alta hospitalaria) (valor p> 0.05, prueba de suma de rango de Wilcoxon). Este es el primer estudio longitudinal sobre los niveles de estrés oxidativo en prematuros alimentados con LHD en comparación con LM.
Para estudiar la evolución longitudinal de los biomarcadores de estrés oxidativo, se evaluaron los valores medios y los rangos intercuartílicos de cada biomarcador detectado en toda la población de estudio (LM y LHD), en diferentes momentos. Los niveles urinarios de 8OHdG / 2dG permanecieron sin cambios. 11 de 15 detectaron isoprostanoides individuales y sustancias relacionadas, así como los NeuroPs y NeuroFs totales permanecieron sin cambios durante el período de estudio. Sin embargo, como se muestra en la Figura 3, la relación o-Tyr / Phe, cuatro isoprostanoides individuales, IsoPs totales, IsoFs totales y dihomo-IsoFs totales cambiaron significativamente durante el período de estudio (valores de p <0.05, prueba de suma de rangos de Wilcoxon).
Respecto al análisis de expresión genómica en células intestinales exfoliadas, un total de 47 recién nacidos prematuros de < 32 semanas de gestación y / o ≤1500 g de peso al nacer que recibieron LM (N = 27) o LHD (N = 20) se incluyeron en el estudio.
Realizamos un Análisis de Componentes Principales (ACP) de la expresión génica en CIEE de recién nacidos prematuros menores de 32 semanas de edad gestacional, de forma tridimensional, simplificando la identificación de patrones y fuentes de variabilidad en un amplio conjunto de datos. Se observa una gran similitud entre los grupos LM y LHD, aunque existe una variabilidad del 12,1% entre ambos.
Los genes expresados diferencialmente (DEG) derivados del análisis ANOVA (valor p <0.05) revelaron cambios estadísticamente significativos en 1629 transcripciones de CIE en neonatos alimentados con LM versus LHD. De estos, 807 genes estaban regulados al alza (49.5%), y 822 estaban regulados a la baja (50.5%) en los grupos LM, en comparación con el grupo de LHD.
El criterio para elegir la mayoría de los genes sobreexpresados e infraexpresados en recién nacidos prematuros alimentados con LM en comparación con aquellos alimentados con LHD, fue el valor absoluto de cambio de pliegue de | 1.6 |.
El grupo de LM sobreexpresó el gen de la lactoalbúmina alfa (LALBA), el gen de la subunidad I de la citocromo C oxidasa (COX1) y el gen kappa de las caseínas (CSN3), el gen beta (CSN2) y el gen alfa (CSN1S1) y el gen del factor citosólico de neutrófilos 1 (NCF1) infraexpresado en comparación al grupo LHD.
Esto explica la falta de activación de las vías inflamatorias, la formación de citocinas no inflamatorias y el bloqueo de la generación de radicales libres de oxígeno (ROS). Posteriormente realizamos una validación de los genes COX1 y NCF1 mediante Real Time-PCR.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES:
En relación con la microbiota, nuestros resultados han demostrado que el tipo de alimentación recibida en los recién nacidos prematuros < 1500 gramos / < 32 semanas de edad gestacional, tiene un impacto importante en la composición microbiana intestinal de los mismos. Así, descubrimos que los perfiles microbianos inducidos por LM vs LHD eran diferentes.
Ajustando por género, edad de gestación y peso al nacimiento, se pudo comprobar que la diversidad de la microbiota intestinal aumentó con la edad postnatal y fue siempre mayor en los lactantes alimentados con LM en comparación con los lactantes alimentados con otros tipos de alimentación.
Finalmente, en aquellos alimentados con fórmula, el perfil microbiano fue distinto de los observados en LM y LHD, lo que sugiere que ésta última, favorece un microbioma intestinal más similar a aquel inducido por LM, a pesar de las diferencias entre las características de ambas leches. Esto podría tener posibles efectos beneficiosos a largo plazo sobre la funcionalidad intestinal, el sistema inmunológico y las actividades metabólicas.
Los perfiles de KEGG en LHD y LM que encontramos en nuestros estudios, indicaban que eran más similares entre ambos, que aquellos observados en los prematuros alimentados con fórmula. El perfil funcional de los prematuros alimentados con LM está representado principalmente por el sistema de secreción bacteriana, la biosíntesis de LPS y proteínas, que se relacionarían principalmente con la presencia de bacterias Gram negativas. Curiosamente, observamos una reducción significativa en la biosíntesis de LPS y proteínas en prematuros alimentados con fórmula en comparación con aquellos alimentados con LM o LHD (sin diferencia entre ellos).
En nuestro contexto, LM y LHD modulan la microbiota intestinal en recién nacidos prematuros provocando un enriquecimiento de Bifidobacterium spp. y Bacteroides spp. que podría promover la señalización específica de LPS y su contribución al sistema inmune. El grupo de FP, presentó una reducción significativa en comparación con los grupos que recibieron LM o LHD en las funciones derivadas de la presencia de oligosacáridos e involucradas en el metabolismo complejo de carbohidratos (por ejemplo, la biosíntesis de glucano).
Estas diferencias podrían explicarse por la abundancia de bacterias metabolizadoras de oligosacáridos como Bifidobacterium y Bacteroides spp. en intestino de prematuros alimentados con LM y LHD en comparación con el grupo alimentado con FP.
En nuestro trabajo, también encontramos enriquecimiento en las funciones relacionadas con el metabolismo de los ácidos grasos y el metabolismo de azufre y nitrógeno en los grupos de LM y LHD. Varias bacterias entéricas y orales producen azufre y nitrógeno reducidos y quizás algunas bacterias específicas, como Deltaproteobacteria, Clostridium spp., Veillonella spp., Rothia spp., serían responsables de esta contribución funcional, ya que se encuentran enriquecidas en el grupo de LHD y también en el de LM.
En el metagenoma de los prematuros alimentados con fórmula, observamos el enriquecimiento de las funciones KEGG relacionadas con el metabolismo del azúcar como el metabolismo de la galactosa, que está involucrado en la conversión de galactosa en glucosa. Esto podría surgir del consumo de Fórmula y / o productos lácteos. También están enriquecidas en este grupo las funciones KEGG relacionadas con el metabolismos de amino azúcares y nucleótidos (251).
En general, se observaron menores diferencias en los perfiles funcionales entre aquellos prematuros alimentados con LM y LHD, lo que sugiere el efecto potencial de la LHD al imitar la funcionalidad del microbioma inducido por la alimentación con leche materna. Estos resultados son prometedores y abrirían nuevas posibilidades en futuras investigaciones que deberían llevarse a cabo. Sin embargo, observamos dos factores importantes que podrían influir en las diferencias encontradas en la microbiota intestinal de los prematuros alimentados con LM o con LHD.
El primer factor estaría relacionado con el momento de la extracción de la leche en relación con la edad gestacional y la etapa de lactancia. Mientras que la LM es el producto biológico de una gestación interrumpida de forma prematura, la LHD procede principalmente de madres que dieron a luz neonatos a término, e iniciaron la donación como mínimo 3 meses tras el parto. Se trata, por tanto, de una leche madura, con un cambio en su composición respecto a la leche de madre con parto prematuro. Aunque la leche materna es muy variable entre los individuos, se descubrió que la edad postnatal y la etapa gestacional (pretérmino versus término) son predictores importantes de la composición de la leche materna (252). Así, el calostro presenta más proteínas, grasa y lactosa tanto en leche prematura cómo en la leche a término, comparado con la leche madura. A medida que la leche va madurando, con el paso del tiempo se produce un cambio en su composición. Todos estos factores son indispensables no solo para una nutrición adecuada sino también para promover la colonización de microbiota.
El segundo factor estaría relacionado con el procedimiento de pasteurización que inevitablemente altera los componentes termolábiles, algunos de los cuales son esenciales.
Por lo tanto, las diferencias encontradas en la microbiota fecal de los prematuros alimentados con LM vs LHD, se explicarían, al menos parcialmente, por la diferente composición del nutriente recibido y sus compuestos bioactivos como los marcadores inmunes, la microbiota, los oligosacáridos, los factores neurotróficos y de crecimiento, entre otros.
No se encontraron diferencias estadísticamente significativas en los niveles de un panel completo de biomarcadores de estrés oxidativo, adecuados para una evaluación in vivo no invasiva, en orina de los recién nacidos prematuros de ambos grupos. Con base a estos resultados, planteamos la hipótesis de que la LHD, a pesar de la pasteurización, es una alternativa válida cuando la LM no está disponible, ya que protege a los prematuros del estrés oxidativo tan bien como la LM, previniéndoles así de condiciones asociadas al daño por radicales libres y por las defensas antioxidantes inmaduras y, en consecuencia, su uso podría prevenir enfermedades relacionadas con el mismo.
El estudio de la expresión genómica en las CIEE, el microbioma y los compuestos volátiles ácidos permite investigar las interacciones mutualistas huésped-microbiota en el lactante de forma no invasiva y podría utilizarse para estudiar prospectivamente el desarrollo intestinal o, preventivamente, para identificar posibles desencadenantes de enfermedad (sepsis, enterocolitis). Por este motivo, varios autores alegaban que la nutrición desempeña un papel importante en la regulación del desarrollo y la función intestinal neonatal y su objetivo fue identificar conjuntos de genes (combinaciones) que se regulan de manera diferencial en respuesta al tipo de la alimentación.
Utilizando un método de recolección de muestras no invasivo previamente validado analizamos el perfil transcripcional de prematuros alimentados con LM vs LHD.
Nuestros resultados revelaron la sobreexpresión de genes de diferentes tipos de caseínas y lactoalbúmina en recién nacidos prematuros alimentados con LM. Estos cambios son consistentes con el mayor contenido de proteínas de la leche obtenida de madres de prematuros en comparación con las madres de niño a término que donan leche madura, a partir de los 3 meses del parto y donan leche madura al banco.
También se mostró que la LM indujo una expresión diferencial de genes específicos que podrían contribuir a una respuesta más eficiente frente a un desafío pro-oxidante temprano en el período posnatal cuando los prematuros tienen un mayor riesgo de estrés oxidativo. debido a la expresión diferencial de genes altamente específicos, como COX1, PPAR-alfa, NCF1 y NFκB.
Mostramos que en los recién nacidos prematuros alimentados con LM, la expresión de NCF1 está regulada de forma negativa y, al mismo tiempo, COX1 regulada de forma positiva. Estos cambios podrían explicar por qué la LM fresca tiene mayores propiedades antiinflamatorias y antioxidantes que la leche pasteurizada . La proteína codificada por este gen NCF1 es una subunidad citosólica de la NADPH oxidasa de neutrófilos (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidasa). Esta oxidasa es una enzima que se activa para producir anión superóxido y, posteriormente, estrés oxidativo.
La regulación negativa de NCF1 reduce también la producción de citocinas, por lo tanto, desempeña un papel esencial en la modulación de la autoinmunidad, los procesos inmunológicos, la inflamación, las respuestas proliferativas y la apoptosis.
El gen COX1 regula el flujo de electrones a través de la cadena de transporte de electrones mitocondriales y la formación de H2O, reduciendo así la generación de radicales libres y, secundariamente, la activación de las vías proinflamatorias. Además, COX1, a través de la interacción con la proteína chaperona HSPA8, también juega un papel importante en condiciones prooxidantes, como la hipoxia-reoxigenación mediante la inactivación de NFκB y las vías pro-apoptóticas. Además, el receptor alfa activado por proliferador de peroxisomas (PPAR-α) también inhibe la NFκB, pero no la proteína quinasa activada por el estrés.
Las diferencias en la microbiota intestinal inducidas por una dieta diferente podrían ser un factor mediador potencial para inducir los cambios en el perfil de expresión génica. Pero a nivel sistémico, no se observan diferencias en los niveles de estrés oxidativo entre LM y LMD.
En conjunto, los 3 estudios subrayan la importancia del uso de la LM en los prematuros menores de 32 semanas, menores de 1500 gramos. Por otra parte, se debe promover los bancos de leche materna que proporcionen LHD para la nutrición de los prematuros en situaciones en las que la LM no está disponible o el volumen es insuficiente.
Así mismo, es necesario promover mejoras en los métodos de pasteurización para mejorar la conservación de los componentes esenciales de la LM y en consecuencia, mejorar la calidad de la LHD.
CONCLUSIONS: 1. Donor human milk favors the development of a gut microbiome that resembles the microbiome acquired by infants nourished by their own mother’s milk more than microbiome in formula fed infants. Nonetheless, preterm infants nourished donor human milk, have a distinct microbial profile but shortage in the microbial diversity and richness present in the gut microbiome of infants fed with owns mother milk.
2. Despite these differences, donor human milk confers beneficial potential effects upon intestinal functionality, immune system and metabolic activities.
3. Preterm infants nourished with donor human milk have similar antioxidant capacity as preterm fed own mother's milk as reflected in the level of urinary biomarkers of oxidative damage to proteins, DNA or lipids.
4. The variability in terms of transcriptomic expression in exfoliated intestinal cells was 12.1% between own mother´s milk and donor human milk. Nevertheless, 1629 genes were differentially expressed between both groups.
5. The candidate genes with different expression between preterm nourished with own mother’s milk and donor human milk were Lactalbumin alpha (LALBA), Casein kappa (CSN3), Casein beta (CSN2), Casein alpha-1 (CSN1S1), Cytochrome C oxidase subunit 1 (COX1), Neutrophil cytosolic factor 1 (NCF1).
6. The biological analysis of these genes indicates that donor human milk possesses a lower anti-inflammatory potential than its own mother´s milk. This is important in terms of its ability to protect against pathogens and the development of necrotizing enterocolitis.
7. Notwithstanding the differences, our studies show many data in favor of important advantages of donor human milk over formula milk. Conversely, new pasteurization methods that preserve the integrity of donor human milk should be developed.
