Efectos de la neurregulina sobre la regeneración nerviosa a través de prótesis acelulares en neurectomías

• Autores: Eugenio Ignacio Alcalde Domínguez
• Directores de la Tesis: Manuel José Gayoso (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Valladolid ( España ) en 2012
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: José Vilches Troya (presid.), Manuel Garrosa García (secret.), Eduardo Weruaga Prieto (voc.), María Julia Araceli Buján Varela (voc.), José María Fidel Fernandez (voc.)
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Biología animal (zoología)
      • Histología animal
    • Biología celular
      • Morfología celular
  • Ciencias tecnológicas
    • Tecnología médica
      • Órganos artificiales
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: UVADOC
• Resumen

  • FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CELULAR, HISTOLOGÍA Y FARMACOLOGÍA INSTITUTO DE NEUROCIENCIAS DE CASTILLA Y LEÓN TESIS DOCTORAL:

    EFECTOS DE LA NEURREGULINA SOBRE LA REGENERACIÓN NERVIOSA A TRAVÉS DE PRÓTESIS ACELULARES IMPLANTADAS EN NEURECTOMÍAS Presentada por Eugenio Ignacio Alcalde Domínguez para optar al grado de Doctor por la Universidad de Valladolid Dirigida por: Prof. Manuel José Gayoso Rodríguez INTRODUCCIÓN Las lesiones de los nervios periféricos tienen como consecuencia la pérdida total o parcial de las funciones motoras, sensoriales y autónomas correspondientes a las áreas denervadas del cuerpo. Esto es debido a la interrupción de la continuidad de los axones, a la degeneración de las fibras nerviosas distales a la lesión y a una eventual muerte de las neuronas axotomizadas. Las lesiones del sistema nervioso periférico son un problema bastante común y pueden derivar en una sustancial pérdida de funcionalidad y en la disminución de la calidad de vida debido a la permanente disminución de las funciones motoras y sensoriales. Además, pueden dar lugar a otros problemas secundarios, como son los dolores neuropáticos. Estas patologías tienen una gran repercusión social en términos de tratamiento sanitario y largos periodos de incapacidad (Jaquet et al., 2001; Rosberg et al., 2005). En Europa se dan más de 300.000 casos al año de lesiones del sistema nervioso periférico. A pesar de la reparación quirúrgica, la discapacidad suele perdurar durante el resto de la vida de muchos pacientes (Nicholson y Verma, 2004; Taylor, 2006).

    Sin embargo, el sistema nervioso periférico, al igual que otros muchos tejidos del ser humano adulto, es capaz de repararse y de regenerarse. Ramón y Cajal ya observó que tras la axotomía, se originaban numerosas ramificaciones desde cada axón, inervando varios tubos de células de Schwann en el extremo distal de la lesión (Ramón y Cajal, 1928). Ramón y Cajal también demostró el fenómeno del neurotropismo (quimiotropismo), por el cual los axones en regeneración crecían preferentemente a través del segmento distal del nervio y no a través de otros tipos de tejidos (Ramón y Cajal, 1928). Los axones de las motoneuronas en el sistema nervioso periférico, al contrario que en el sistema nervioso central, tienen una gran capacidad de regeneración. Las neuronas sensitivas primarias tienen también la capacidad de regenerar su axón lesionado. Esta capacidad, sin embargo, es mucho mayor para el axón periférico de la neurona sensitiva que para la rama del axón que se dirige centralmente (Donnerer, 2003). Esto podría explicarse por los factores neurotróficos presentes en el tejido periférico que favorecen el crecimiento de las neuritas. Sin embargo, la rama del axón que se dirige hacia el sistema nervioso central se encontrará tejido glial inhibidor en la zona de la raíz dorsal (Ramer et al., 2002).

    Una lesión nerviosa es diferente de la mayoría de las lesiones de otros tipos de tejidos del organismo, ya que no requiere tan sólo una reparación local. La sección de los axones tiene implicaciones en toda la longitud de la neurona (esto es, desde el cuerpo celular en la médula espinal o en el ganglio raquídeo, hasta las dianas terminales) y el proceso de reparación implica el crecimiento de neuritas a lo largo de grandes distancias. Además, al contrario que otros tipos de lesiones en el organismo, la lesión del nervio tiene consecuencias funcionales inmediatas para el cerebro en términos de rápidas reorganizaciones en la corteza cerebral (Lundborg, 2000; Navarro et al., 2007).

    El tejido nervioso, debido a su complejidad y a sus conexiones de larga distancia, se repara en realidad mediante una verdadera regeneración. La reparación mediante cicatrización no permitiría restablecer la correcta conectividad eléctrica (Fine et al., 2000). Desde las primeras descripciones de la degeneración y regeneración del sistema nervioso por parte de August Waller (1850) y de Santiago Ramón y Cajal (1928), numerosos autores han propuesto diversas aproximaciones experimentales para la reparación quirúrgica de las lesiones por sección de los nervios periféricos (Sunderland, 1951; Swaim, 1972; Johnson et al., 2005) y para la regeneración de grandes extensiones de tejido nervioso perdido (Lundborg, 2000; 2004). Desde hace unos años la Ingeniería Tisular propone nuevas aproximaciones experimentales para la reparación y regeneración de los nervios periféricos lesionados. Así, a mediados de los años 80 se empezaron a emplear materiales naturales y sintéticos para la fabricación de tubos para reparar grandes lesiones de los nervios. El concepto de prótesis tubular se apoya en tres hipótesis: A) La regeneración nerviosa puede ser favorecida si el traumatismo quirúrgico se minimiza. B) Un pequeño espacio entre los cabos seccionados dentro del tubo puede incrementar las posibilidades de actuación de los mecanismos neurotrópicos y neurotróficos. C) Un sistema cerrado permitiría la acumulación de los factores de crecimiento que son liberados por el tronco nervioso tras la lesión (Lundborg, 2000). El objetivo es utilizar materiales naturales y artificiales para obtener un tejido semejante al biológico con las propiedades adecuadas para la reparación tisular.

    Todos los tejidos, desde un punto de vista general, están formados por células y matriz extracelular. La matriz extracelular juega un papel fundamental proporcionando un medio ambiente favorable para las células y manteniendo de la estructura propia de cada tejido. Además, numerosas moléculas bioactivas intervienen en la comuncación celular en el medio ambiente tisular. De esta manera, los tres elementos básicos que necesita la Ingeniería Tisular son: células, un armazón o matriz extracelular y señales celulares como, por ejemplo, factores de crecimiento (Johnson et al., 2005).

    La unidad básica de un nervio periférico es la fibra nerviosa, que se define como la asociación de uno o varios axones neuronales con una serie de células de Schwann (Fine et al., 2000). La célula de Schwann proporciona soporte estructural y equilibrio químico a las neuronas del sistema nervioso periférico (Fine et al., 2000). La célula de Schwann puede envolver uno o más axones originando así una fibra nerviosa. Una fibra nerviosa mielínica se compone de segmentos mielínicos en los que una célula de Schwann envuelve a un único axón (de un diámetro aproximado de 1 a 30 µm). La vaina de mielina es una doble espiral lipoproteica que actúa como aislante y acelera la transmisión del impulso nervioso a lo largo del axón y por lo tanto, es muy importante para los movimientos reflejos rápidos, como el reflejo rotuliano (Zorick y Lemke, 1996). Las fibras nerviosas amielínicas (o fibras de Remak) tienen otra organización morfológica. Numerosos axones de pequeño diámetro (de 0.4 a 1.2 ¿m) están rodeados por invaginaciones o pseudópodos de una célula de Schwann sin formar vainas de mielina (Navarro et al., 2007; Zochodne, 2008). Rodeando la fibra nerviosa, ya sea mielínica o amielínica, se encuentra la lámina basal formada por las células de Schwann, que es continua en los nodos de Ranvier en las fibras mielinizadas (Ide, 1996).

    Las células de Schwann mielinizantes y las células de Schwann no mielinizantes son fácilmente distinguibles entre si por su diferente expresión génica. Las primeras expresan altos niveles de genes específicos de la síntesis de mielina, como los genes para las proteínas P0 y para la proteína básica de la mielina (MBP) (Lee et al., 1997; Beirowski et al., 2005; Guertin et al., 2005). Por el contrario, las células de Schwann no mielinizantes generalmente no expresan estos genes, y en su lugar presentan una serie de marcadores amielínicos que también se expresan en las células de Schwann inmaduras, tales como proteína glial fibrilar acídica (GFAP) o el receptor de neurotrofinas p75NTR (Hall et al., 1997; Bradley et al., 1998). Las células de Schwann maduras, tanto mielinizantes como no mielinizantes, muestran una fuerte inmunorreactividad a la proteína ligante de calcio S100 (Stefansson et al., 1982b; Sugimura et al., 1989; Baimbridge et al., 1992; Vega et al., 1996).

    Miembros de la familia de las neurotrofinas se unen a receptores tirosina quinasa de alta afinidad llamados trk y al receptor de NGF de baja afinidad llamado p75NTR (Kaplan et al., 1991a; Kaplan et al., 1991b). La activación de un receptor viene seguida de una cascada de señalización intracelular y la consiguiente activación génica (Kandel et al., 2000).

    Las Neurregulinas (NRGs) son proteínas señalizadoras que intervienen en las interacciones célula-célula en el sistema nervioso, el corazón, las glándulas mamarias y otros órganos (Falls, 2003). Actúan a través de receptores tipo tirosina kinasa de la familia ErbB (Adlkofer y Lai, 2000). La ßNRG1 actúa como un potente mitógeno sobre las células de Schwann neonatales de rata, mientras las formas ¿ no son mitogénicas (Raabe et al., 1996). Además, las ßNRG1 favorecen la supervivencia de los precursores de las células de Schwann a E14 de vida embrionaria, mientras las isoformas ¿ no tienen ningún efecto aparente (Dong et al., 1995). Durante la vida postnatal, las proteínas NRG1 son indispensables para la supervivencia de las células de Schwann mielinizantes y premielinizantes (Grinspan et al., 1996; Syroid et al., 1996; Li et al., 2001).

    Las lesiones de los nervios periféricos son comunes, incapacitantes y difíciles de tratar. El tipo de lesión experimentada por un tronco nervioso determina el grado de regeneración que se conseguirá (Lundborg, 1993; Zochodne, 2008). La neurotmesis se define como la sección total del tronco nervioso. Tanto la inervación motora como la sensitiva están interrumpidas. Se da la pérdida completa de función del nervio. Histológicamente, se observa la degeneración de todos los axones distalmente al sitio de la lesión (Lundborg, 1993). Los axones también muestran cambios degenerativos en los dos o tres nodos de Ranvier anteriores al sitio de la lesión (Bradley et al., 1998; Chen et al., 2005; Guertin et al., 2005). Exceptuando casos muy raros, la recuperación espontánea no sucede (Sunderland, 1951). La capacidad de un nervio dañado para la regeneración depende del grado de continuidad del tronco nervioso después de la lesión (Sunderland, 1951; Lundborg, 1993).

    Después de la sección de un nervio periférico, la porción del axón distal al punto de lesión queda desconectada del soma neuronal y degenera. Tanto los axones como los cuerpos neuronales reaccionan de una forma característica (Sunderland, 1951; 1990). El soma de las neuronas axotomizadas sufre una serie de cambios fenotípicos, conocidos como reacción neuronal y cromatolisis. La reacción neuronal y la cromatolisis representan los cambios metabólicos necesarios para la regeneración y la elongación axonal, mientras que la degeneración walleriana crea en el cabo distal de la lesión un microambiente favorable para el crecimiento axonal de las neuronas supervivientes (Navarro et al., 2007; Deumens et al., 2010).

    En el extremo distal de la lesión se da un proceso degenerativo conocido como degeneración walleriana, descrito orignalmente por August Waller en 1850. Cuando las células de Schwann mielinizantes pierden el contacto axonal se desdiferencian y adquieren un fenotipo de célula premielinizante (inmadura) o de célula no mielinizante (Stoll y Muller, 1999). Expresan el receptor p75NTR, la proteína GFAP y otros marcadores (Mirnics et al., 2005). En los dos primeros días después de la lesión, las células de Schwann mielinizantes también disminuyen los niveles normales de ARNm de componentes de MBP, de la glicoproteína asociada a la mielina (MAG) , de la proteína P0, de la proteína mielínica periférica-22 (PMP-22) y de la periaxina (Stoll y Muller, 1999; Kury et al., 2001). La activación del receptor tirosina kinasa erbB2 en las células de Schwann se ha relacionado con la fragmentación de sus propias vainas de mielina (Guertin et al., 2005). Los macrófagos hematógenos son la principal vía para la eliminación de residuos de mielina y de axones (Tanaka et al., 1992). Los macrófagos son atraídos hacia el nervio en degeneración por citoquinas secretadas por las células de Schwann reactivas, tales como la proteína quimioatrayente de monocitos-1, el factor LIF y la interleucina 1 (Tofaris et al., 2002). El reclutamiento de los macrófagos lleva a una rápida eliminación de los residuos de mielina, que contienen inhibidores del crecimiento axonal como la glicoproteína asociada a la mielina (Bruck et al., 1995; Bruck, 1997), y de este modo se facilita la regeneración nerviosa (Stoll et al., 2002). Durante la degeneración walleriana las células de Schwann se dividen estimuladas por la pérdida del contacto axonal, probablemente a través de proteínas liberadas por los axones en desintegración (Karanth et al., 2006), y más tarde por citoquinas secretadas por los macrófagos (Navarro et al., 2007). Las células de Schwann se dividen rápidamente durante las siguientes 2 ó 3 semanas, llegando a triplicarse su número (Salonen et al., 1988). Esto puede deberse en parte a la aparición a los tres días de NRG1, relacionada con la proliferación y superviviencia de las células de Schwann por medio de circuitos autocrinos (Carroll et al., 1997).

    Las células de Schwann que han proliferado se organizan en columnas ordenadas denominadas bandas de Büngner o tubos endoneurales (Yang et al., 2008). Las columnas de células de Schwannen el cabo distal presentan un alto grado de alineamiento y se piensa que esta propiedad topográfica es importante para la dirección del crecimiento axonal (Thompson y Buettner, 2004; 2006). Además, proporcionan un sustrato óptimo para la adhesión del cono de crecimiento y para la elongación axonal (McKerracher et al., 1996).

    La célula de Schwann produce NGF y BDNF tras la lesión del nervio. Los cambios en la expresión de neurotrofinas están acompañados por el aumento de los correspondientes receptores (DiStefano et al., 1992; Funakoshi et al., 1993; Boyd y Gordon, 2001). El ARNm de la NRG1 aparece en el nervio periférico 3 días después de la axotomía y este hecho coincide con la síntesis de ADN en las células de Schwann (Carroll et al., 1997). La expresión de los receptores de Neurregulina ErbB2 y ErbB3 aumenta también rápidamente, alcanzando un máximo entre los 5 y los 7 días después de la lesión (Carroll et al., 1997; Adlkofer y Lai, 2000; Kingham y Terenghi, 2006). A partir del quinto día se observan los receptores ErbB2 activados en células de Schwann del cabo distal seccionado (Kwon et al., 1997).

    Al inicio de la regeneración, varias ramificaciones emergen de cada axón a nivel de los nodos de Ranvier (Witzel et al., 2005). Si los axones en regeneración llegan al cabo distal, crecen a lo largo de los tubos endoneurales formados por las células de Schwann y la lámina basal, constituyendo unidades de regeneración (Zochodne, 2008). La velocidad de la regeneración axonal es muy lenta al principio y alcanza un valor estable a los 3 ó 4 días de la lesión con alrededor de 1 a 3 mm por día (Fu y Gordon, 1997; Lundborg, 2004). El crecimiento axonal requiere un sustrato adecuado de factores trópicos y tróficos proporcionados por las células de Schwann reactivas y por la matriz extracelular en el cabo nervioso degenerado (Verdú y Navarro, 1997). En ausencia de una estructura que sirva de guía, como el cabo distal, los axones en regeneración siguen una ruta tortuosa y pueden formar un neuroma, compuesto por ramificaciones axonales inmaduras y tejido conjuntivo (Swaim, 1972; Okuda et al., 2006). A medida que el crecimiento del axón progresa hacia el cabo distal, tiene lugar la mielinización por parte de las células de Schwann (Zochodne, 2008). El significado biológico de la regeneración es reemplazar el segmento distal del nervio perdido durante la degeneración y reinervar los tejidos diana. Sin embargo, lo más común es que los procesos regenerativos no reconstituyan una estructura nerviosa normal ni consigan una recuperación funcional satisfactoria, especialmente cuando la lesión es severa (Jaquet et al., 2001; Guntinas-Lichius et al., 2005; Johnson et al., 2005). Después de un proceso de lesión de un nervio y su reparación, el diámetro de los axones regenerados, su velocidad de conducción y su excitabilidad, permanecen por debajo de los niveles normales durante largos periodos de tiempo (Fields y Ellisman, 1986), y consecuentemente, la recuperación de los órganos reinervados es incompleta y a menudo inadecuada (Ijkema-Paassen et al., 2001). La limitación de la regeneración nerviosa es mayor cuando la lesión crea una discontinuidad en el nervio, y la regeneración es menor cuanto mayor es el espacio entre los cabos seccionados, tanto cuando se deja el nervio sin reparar como después de una reparación quirúrgica (Butí et al., 1996; Krarup et al., 2002).

    Cuando la distancia entre los cabos es grande (más de 20 mm en humanos), la técnica estándar de reparación es el trasplante autólogo de segmentos de nervio sensitivo (Nichols et al., 2004).

    La Ingeniería Tisular es una nueva área de la Biotecnología cuyo objetivo es la fabricación de equivalentes tisulares orgánicos que puedan ser utilizados para la sustitución de tejidos y órganos dañados (Langer y Vacanti, 1993; Nerem y Sambanis, 1995). El gran desarrollo que ha sufrido esta disciplina durante las últimas décadas se justifica por la escasez de tejidos donantes para las cirugías de trasplantes. Además, la utilización de prótesis artificiales elimina el riesgo de rechazo inmunológico del injerto y evita la utilización de inmunosupresores tras su implantación (Sher et al., 1983).

    En general, la ingeniería Tisular para la reparación de las lesiones de los nervios periféricos se basa en tres componentes básicos: matrices para el soporte mecánico, elementos celulares y factores de crecimiento (Kim et al., 2004).

    Se pueden fabricar conductos para la reparación de lesiones nerviosas a partir de tejidos autólogos o procedentes de cadáveres. Los tejidos deben favorecer el crecimiento de los axones en su interior y presentar una organización lineal que dirija el avance de las fibras nerviosas. Se ha demostrado que varios tejidos autólogos permiten la regeneración del nervio cuando se usan como conductos. Entre ellos están las cubiertas epineurales (Frerichs et al., 2002; Fansa et al., 2003; Kim et al., 2004), tendones, fibras musculares, venas (Geuna et al., 2003; Lundborg, 2004; Keilhoff et al., 2005; Raimondo et al., 2005) y láminas basales extraídas de tejido muscular decelularizado (Schmidt y Leach, 2003). Estos tejidos autólogos han sido también empleados en combinación con factores de crecimiento o revestidos de colágeno para estimular el crecimiento axonal y la migración de las células de Schwann (Fansa et al., 2002; Kim et al., 2004; Raimondo et al., 2005). Sin embargo, estos implantes acelulares, aunque no son inmunogénicos, tienden a producir un grado significativo de inflamación, principalmente porque el proceso de decelularización es incompleto y permanecen restos celulares o porque resultan alterados los elementos de la matriz extracelular (Chalfoun et al., 2006).

    Se han empleado con éxito numerosos materiales sintéticos reabsorbibles en la regeneración de los nervios periféricos. Los constructos basados en Ingeniería Tisular están diseñados para degradarse a una determinada velocidad para permitir la colonización del tejido formado de novo (Sheridan et al., 2000). Poliésteres como el ácido poliláctico, el ácido poliglicólico y copolímeros de ambos (ácico poli(láctico-co-glicólico) (PLGA) están siendo empleados en investigación por su amplia disponibilidad y porque su utilización está aprobada en humanos por la Food and Drug Administration (FDA) del gobierno de los EEUU (Hudson et al., 2000). Sus propiedades físicas, tales como la posibilidad de fabricar un conducto de dimensiones adecuadas, el tamaño de poro de la pared, la textura de la superficie y una serie de propiedades eléctricas inherentes, influyen positivamente en la regeneración del nervio (Hudson et al., 2000). La luz del conducto podría completarse, en términos de Ingeniería Tisular, con materiales que simulasen la apariencia y funcionalidad de la matriz extracelular presente en el interior del nervio periférico (Sheridan et al., 2000). A menudo se pretende imitar la función interactiva de la matriz extracelular. De este modo, se han empleado numerosas moléculas insolubles de la matriz extracelular para estimular la regeneración axonal: laminina, fibronectina, fibrina y algunas formas de colágeno (Madison et al., 1985; Satou et al., 1986; Madison et al., 1987; Rosen et al., 1992). Como biomaterial, el alginato tiene varias ventajas incluyendo que es biocompatible y que no produce reacción inmunológica (Klöck et al., 1997; Shapiro y Cohen, 1997). Una propiedad interesante es su capacidad para formar geles, lo que permite la encapsulación de diversas sustancias (Martinsen et al., 1989; Amsden y Turner, 1999), así como la liberación controlada de factores de crecimiento (Bouhadir et al., 2001; Augst et al., 2006).

    La inclusión de células de soporte neuronal parece imprescindible para la proliferación axonal (Rath et al., 1995). Aunque no se conocen todos los mecanismos que regulan la dinámica de la relación axón/célula de Schwann, numerosos experimentos apoyan el concepto de que las células de Schwann ofrecen un sustrato preferente para la migración axonal y liberan factores bioactivos que incrementan la migración nerviosa (Rath et al., 1995; Sobol et al., 2003).

    La capacidad de los conductos artificiales para facilitar la regeneración axonal depende, en gran medida, de la recolonización de la prótesis por parte de células promotoras de crecimiento (tales como células de Schwann y células endoteliales vasculares). Numerosos factores neurotróficos solubles se pueden incorporar directamente a los conductos artificiales para estimular y regular el desarrollo de un nuevo tejido (Haynes, 1988; Mahanthappa et al., 1996; Sheridan et al., 2000; Zochodne y Cheng, 2000; Whitaker et al., 2001).

    JUSTIFICACIÓN Las lesiones nerviosas en la Unión Europea afectan a más de 300.000 pacientes cada año. Estas lesiones tienen un grado limitado de recuperación y suponen una gran afectación de la calidad de vida del paciente y de su familia, un elevado coste humano para el sistema sanitario y, en muchas ocasiones, la incapacidad motora del sujeto.

    Los métodos estándar de reparación de lesiones con pérdida de tejido nervioso, basados en el trasplante autólogo de un segmento de nervio periférico, no ofrecen resultados satisfactorios en un gran número de casos. Además, para ello es necesario disponer de tejido nervioso donante en suficiente cantidad, lo que implica una complicada intervención quirúrgica adicional y la mutilación de un segmento de nervio sano.

    En los últimos años se han desarrollado estrategias alternativas basadas en la utilización de materiales biológicos o artificiales a modo de conducto que facilite la regeneración nerviosa y la reconexión de los cabos nerviosos separados. En este sentido se crea la necesidad de desarrollar un modelo experimental de regeneración nerviosa a través de un conducto artificial biocompatible y acelular, para estudiar los parámetros biológicos que intervienen en la regeneración y evaluar su posible utilización en la práctica clínica.

    HIPÓTESIS Nuestra hipótesis general es que el implante de un conducto de material biocompatible con un gel en su interior que contenga y libere un factor de crecimiento neural, puede favorecer la regeneración de un nervio seccionado, sin la necesidad de añadir elementos celulares trasplantados.

    Para confirmar esta hipótesis nos hemos planteado los objetivos siguientes: OBJETIVOS 1. Elaborar una prótesis artificial biocompatible y absorbible para implantar en una neurectomía de 3 cm.

    2. Diseñar la estructura interior de la prótesis para evitar su colapso y que además actúe como medio ambiente extracelular capaz de inmovilizar y liberar un factor neurotrófico como la ß-Neurregulina 1 de tipo I.

    3. Determinar la velocidad de la regeneración de los nervios seccionados a través de las prótesis sin ß-Neurregulina 1 y con ß-Neurregulina 1.

    4. Establecer los cambios fenotípicos detectables con métodos inmunohistoquímicos, de los elementos celulares que participan en la regeneración nerviosa.

    MATERIALES Y MÉTODOS El animal empleado para la elaboración de esta Tesis Doctoral es el conejo, Oryctolagus cuniculus L. 1758 (Leporidae, Lagomorpha, Mammalia) de la raza New Zealand. Los animales se mantuvieron a temperatura y humedad relativa constantes, con un fotoperiodo artificial de 12/12 horas y fueron alimentados ad libitum con agua y pienso compuesto para conejos (Rodent toxicology diet, B&K Universal G.J., S.L. Molins de Rei, Barcelona).

    Se emplearon un total de 30 conejos divididos en 6 grupos experimentales según el tiempo de supervivencia tras el implante de la prótesis (15 días, 30 días, 75 días) y la presencia o no de factor de crecimiento.

    Todos los animales se mantuvieron, manipularon y sacrificaron según las líneas establecidas en la directiva del Parlamento Europeo y del Consejo de las Comunidades Europeas (2010/63/UE) y de la legislación española (RD 1201/2005 y Ley 32/2007) vigentes para el uso y cuidado de animales de laboratorio.

    La prótesis tiene un diseño tubular de 30 mm de longitud y un diámetro interior de 3 mm. Está fabricada con ácido poli(láctico-coglicólico). La proporción relativa de cada polímero es de 85/15. En su interior se hallan insertadas dos láminas del mismo material que funcionan a modo de andamiaje. Además, se ha rellenado con un hidrogel de alginato suplementado, en su caso, con ß-Neurregulina 1 como factor de crecimietno.

    Las muestras biológicas obtenidas tras el implante de las prótesis y pasado el periodo de supervivencia adecuado, se procesaron para realizar técnicas de inmunofluorescencia y para microscopía electrónica.

    Se emplearon los siguientes marcadores: ¿ Neurofilamentos 200 kD (NF) ¿ Proteína ligante de Calcio S100A1 (S100) ¿ Receptor de neurotrofinas p75 (p75NTR) ¿ Inmunofluorescencia doble NF + p75NTR RESULTADOS Como resultados más notables podemos resaltar que los implantes suplementados con NRG1 producen un efecto acelerador de la regeneración axonal. Tras 15 días de tratamiento pudimos observar diferencias significativas (p<0.0001) en la distancia recorrida por los axones desde el límite original de la lesión proximal. Así, describimos que la distancia sin la adición de NRG1 era de 4.24 ± 0.15 mm, mientras que con las prótesis suplementadas con NRG1 la distancia aumentaba a 5.83 ± 0.27 mm. Este incremento en la progresión de los axones estaba acompañado por un aumento similar en el número de células de Schwann y en la distancia que recorrieron hacia el interior del conducto. Además, hemos descrito un cambio en el fenotipo en las células de Schwann después de una lesión por neurotmesis, indicado por el cambio de expresión entre los marcadores S100 y p75NTR. Sólo las células de Schwann que permanecen en la región del nervio no afectada mantienen una expresión detectable de la proteína S100 en sus citoplasmas. Por el contrario, las CS que han proliferado y migran acompañando a los axones en regeneración, expresan p75NTR. Asimismo, se encontró un mayor número de CS en el cabo distal de los nervios reparados con prótesis con NRG1 que en los no tratados. Además, estas células de Schwann penetraban una mayor distancia en el interior del conducto.

    Figura 11: Composición de micrografías representando el primer segmento completo de un injerto suplementado con NRG1 y extraído tras 15 días. La parte inferior de la imagen es la más cercana al cabo nervioso proximal. En la parte superior se pueden apreciar numerosos axones NF+ penetrando en el conducto. Los axones NF+ avanzan un total de 5.83 ± 0.27 mm. Se observa una extensión similar de las células de Schwann p75NTR+. (Barra de escala: 250 µm).

    Treinta días después de ser implantados los constructos bioabsorbibles sin NRG1 mostraban los siguientes resultados: Tomando áreas seleccionadas de micrografías representativas, se calculó la densidad de axones mielinizados en este nivel, resultando de 3.08 axones por cada 100 µm2. El calibre medio de las fibras mielinizadas se estimó en 1.83 µm y el del axón sin su envoltura, en 1.43 µm. La potencia media de las vainas de mielina se calculó en 0.20 µm. Estos datos arrojaron una ratio G de 0.78 para los axones mielinizados en la prótesis no suplementada con NRG1. La ratio G normal para un nervio humano es de alrededor de 0.65 y es independiente de las dimensiones del axón. Este valor está altamente conservado entre los mamíferos, por ejemplo, la ratio G correspondiente al nervio ciático de conejo no lesionado es también de 0.65, según nuestros propios cálculos.

    Los axones recorrieron una distancia aproximada de 13 mm desde el origen de las fibras regenerativas, con lo que avanzarían una media de 0.43 mm por día durante los 30 primeros días. Estos axones se observaron acompañados en todo momento por CS que presentaban inmunorreactividad para el receptor p75NTR. La tinción contra S100 resultó muy débil o inexistente en esta región. Sin embargo, todavía hay grandes áreas ocupadas por PLGA y alginato que se aprecian como zonas vacías de elementos celulares en las secciones longitudinales. En general, las zonas ocupadas por tejido se localizan adhheridas a la pared interna del tubo.

    Al igual que en el grupo no tratado, en los cabos nerviosos proximales de los animales a los que se implantó durante 30 días una prótesis suplementada con NRG1, se detectó una tinción intensa para el anticuerpo anti-S100. El aspecto general del nervio en su región no afectada era normal. No se registraron elementos p75NTR+ aparentes en el nervio. Los axones en regeneración se introducían en el conducto en gran número. Su orientación fue en todo momento correcta, paralela al eje mayor del nervio y su distribución en el tejido era ordenada. En la región más cercana al nervio proximal coincidían los marcajes para S100 y p75NTR, aunque era más débil para p75NTR. La morfología de las fibras p75NTR+ era coincidente con la descrita anteriormente para los cordones S100+. En un corte transversal de las fibras a este nivel pudimos observar que el receptor p75NTR se presentada en los procesos de las CS pero también se expresaba en la envuelta perineural del minifascículo. A medida que las fibras se alejaban del nervio proximal en sentido anterógrado, descendía levemente la inmunofluorescencia para S100 mientras eran más comunes los perfiles p75NTR+. Muchas de las CS p75NTR+ a este nivel formaban parte de gruesos cordones de axones mientras que otras mostraban una morfología filamentosa y se veían unidas a axones aislados.

    El estudio de la ultraestructura de muestras representativas de estas secciones reveló un mayor número de vainas de mielina por área que en el grupo no tratado con NRG1. Concretamente estimamos 3.98 axones por cada 100 µm2. Tanto el diámetro de las fibras mielinizadas como el de sus axones era ligeramente mayor que en el grupo sin NRG1. El diámetro de las fibras se estimó en 1.98 µm mientras que el de sus axones fue de 1.50 µm. Así, calculamos una potencia media de las vainas de mielina de 0.24 µm, también ligeramente superior a la registrada en el otro grupo. De esta manera, la ratio G en este grupo seguía siendo más cercana a la unidad que en un nervio normal, y muy similar a la del grupo no tratado (G = 0.75). La morfología general de los minifascículos y de los elementos del estroma son similares a los descritos anteriormente para el grupo sin NRG1. En las fibras amielínicas podemos diferenciar las prolongaciones axónicas de los procesos de las células de Schwann porque los axones presentan una sección transversal circular y contienen neurotúbulos y neurofilamentos. La presencia de estos elementos hace que el axoplasma sea ligeramente más denso a los electrones que el citoplasma de las células de Schwann.

    Figura 26: Imagen de microscopía electrónica correspondiente a los cortes de la figura 23. Se muestra una fibra nerviosa mielinizada. En el axón se pueden observar los neurofilamentos en el axolema. En la célula de Schwann es patente el núcleo regular y claro, así como la lámina basal que delimita el perímetro de la fibra. (Barra de escala: 500 nm).

    La distancia total aproximada recorrida por los axones (identificados por ser NF+ y formar cordones S100+) desde el borde del cabo nervioso proximal es de 15.40 mm. Este cálculo supondría un avance medio diario de 0.51 mm durante los 30 primeros días. A este nivel pudimos observar los fascículos de axones asociados a células de Schwann S100+. Estos fascículos también tenían el aspecto de cordones pero eran menos gruesos. En la misma localización aparecía marcaje para p75NTR. En las zonas más alejadas, donde los axones eran más escasos, no se registró marcaje para S100 y sin embargo, los axones estaban acompañados por procesos filamentosos p75NTR+. Más allá el conducto se encuentra ocupado por restos de alginato en degradación y por fragmentos de láminas de PLGA, como en el caso de los implantes no tratados.

    En los implantes sin NRG1 extraídos a los 75 días pudimos observar lo siguiente: el tejido nervioso regenerado ocupaba la totalidad del interior del conducto. En la periferia de la luz del tubo los axones se presentaban asociados en paquetes rodeados y aislados por envueltas de tejido conjuntivo a modo de perineuro. Los minifascículos contenían entre 8 y 20 axones mielinizados. En la parte más interna de la luz, los minifascículos parecían tener los límites más difusos, en algunos casos formando fascículos mayores con delgados tabiques fibrosos en su interior. Los minifascículos contenían numerosos axones mielinizados y también fibras no mielinizadas difícilmente identificables en las secciones semifinas. Las fibras mielinizadas presentaban un diámetro medio de 4.87 ± 0.16 µm (media ± SEM), siendo el calibre medio de los axones de 3.65 ± 0.12 µm. La ratio G estimada a partir de estos registros es de 0.75, indicando que los axones presentan Las fibras mielinizadas encontradas al final del conducto eran ligeramente más delgadas que las estudiadas en el segmento anterior, habiéndose calculado su diámetro en 4.26 ± 0.16 mm. Los axones mostraron grosores de 3.64 ± 0.12 mm. Su envoltura de mielina también era más fina, según se desprendía del valor de su ratio G, que era de 0.85. La mayor parte de los axones mielinizados eran de pequeño tamaño (entre 2 y 4 µm) y presentaban delgadas vainas de mielina de alrededor de 320 nm. La mayoría de los axones mielinizados se encontraron en los minifascículos de la periferia.

    En el caso de los implantes suplementados con NRG1, el aspecto exterior del injerto en las zonas de coaptación al nervio, era el de un nervio normal. La pared polimérica se había reabsorbido casi por completo en los extremos y permitían ver una imagen del nervio regenerado con vasos en su superficie, un epineruro uniforme y apariencia de continuidad.

    Las fibras mielinizadas mostraron un calibre medio de 6.86 ± 0.14 µm, siendo calculado el diámetro de los axones en 4.69 ± 0.09 µm. La ratio G aproximada obtenida con estos datos es de 0.68, cercana a la esperada para un nervio normal (G = 0.65). La observación de las secciones ultrafinas correspondientes reveló que las fibras mielinizadas presentaban una vaina de mielina bien estructurada y gruesa (alrededor de 1.08 µm). Los minifascículos estaban limitados por fibroblastos y por una matriz rica en fibras colágenas densamente empaquetadas.

    En la porción final, las fibras mielinizadas tenían un grosor medio de 5.30 ± 0.09 µm y sus axones presentaban calibres de 4.09 ± 0.16 µm. Estas fibras eran ligeramente más finas que las encontradas en los segmentos anteriores (más cercanos al cabo proximal) y presentaron una ratio G de 0.77. Los minifascículos se distribuían preferentemente por la periferia del conducto, dejando la zona más interna ocupada por un tejido más pobre en fibras mielinizadas pero abundante en fibras no mielinizadas, como pudimos comprobar al estudiar los cortes ultrafinos correspondientes. En algunos casos, grupos de axones pequeños colonizaban la zona asociados a procesos de una célula de Schwann. Observamos una forma de asociación distinta a la de una fibra amielínica típica en estos casos. En primer lugar se podían encontrar varios axones yuxtapuestos, sin interposición entre ellos de prolongaciones citoplasmáticas de la CS. Además, algunos de ellos se encontraban expuestos al medio extracelular, sin la cobertura del citoplasma de la CS. Eso sí, estaban protegidos por la lámina basal de la célula de Schwann. En la parte final del injerto pudimos observar numerosos axones NF+ en dirección al nervio distal. En la salida del conducto, hacia el cabo distal del nervio, el estroma regenerativo mostraba gran cantidad de axones en regeneración formando cordones como los observados en el segmento central del injerto. En estos cordones, bien orientados en su mayoría, observamos un intenso marcaje para la proteína S100 , pero también una fuerte afinidad por el anticuerpo contra el receptor p75NTR. Muchos de estos axones fueron registrados penetrando largas distancias en el tejido del nervio degenerado (hasta 3 cm más alejados del final de la prótesis), integrándose en las bandas de Büngner formadas anteriormente por las células de Schwann y las células endoneurales. En estas fibras regeneradas, cuanto mayor era la distancia recorrida por el axón, las células de Schwann se mostraban positivas para p75NTR y la intensidad del marcaje S100 detectado era cada vez más débil.

    DISCUSIÓN Según la literatura existente, en espacios superiores a 10 ó 15 mm no se da regeneración nerviosa en el nervio ciático de la rata sin la adición de sustancias tróficas adicionales, o ésta es muy pobre (Lundborg et al., 1982). La mayoría de las aproximaciones experimentales, además, requieren la utilización de una fuente externa de células de Schwann o de otros tipos celulares que imiten su función (Brown et al., 1996; Cheng y Zochodne, 2002; Amoh et al., 2005; Choi et al., 2005; Chalfoun et al., 2006).

    En el ser humano, los axones crecen una media de 1 mm por día (Lundborg, 2000). En nuestras observaciones utilizando prótesis bioabsorbibles, hemos encontrado un crecimiento menor, tanto en el caso de los conductos suplementados con NRG1 como en los no tratados. Hemos observado velocidades de crecimiento axonal de 0,43 mm por día en los conductos no tratados y de hasta 0,51 mm por día en los que contenían NRG1. En el periodo máximo de tiempo estudiado (hasta 75 días), hemos observado que las fibras nerviosas han atravesado, en gran número, la prótesis ineterpuesta entre los dos cabos seccionados. Hemos de tener en cuenta que las estimaciones de la velocidad de crecimiento axonal que encontramos en la literatura, se refieren en su inmensa mayoría, a un supuesto en el que se da una sección de un tronco nervioso solucionable con la aproximación quirúrgica de ambos cabos, esto es, sin que haya un espacio vacío entre ellos. De esta manera, los axones en regeneración encuentran rápida y fácilmente el cabo nervioso distal y numerosas bandas de Büngner accesibles y con un ambiente neurotrófico óptimo. El siguiente supuesto más citado es el autotrasplante de un segmento de nervio sensorial para solucionar una lesión en la que hay pérdida de tejido nervioso. Este modelo, empleado como referencia en la clínica, presenta la ventaja de ser un injerto de un material autólogo y que porta una fuente importante de células de Schwann compatibles. Más adelante expondremos alguna de los inconvenientes de esta técnica. En nuestro modelo, la regeneración de los axones no está ayudada a priori por ningún elemento exógeno (a excepción del factor de crecimiento añadido a los grupos correspondientes), ya que unas de nuestras aspiraciones sería evitar la necesidad de extirpar un nervio sano para la reparación y disponer de una prótesis nerviosa preparada en el momento perioperatorio. El trasplante autólogo tiene varios inconvenientes. El diferente tamaño del diámetro y longitud del injerto utilizado puede llevar a una pobre recuperación funcional. La unión inadecuada de los fascículos donantes y receptores a la hora de la cirugía puede llevar a un fallo clínico. La tensión en las líneas de sutura puede derivar en dehiscencia y fracaso (Deumens et al., 2010). Finalmente también influyen factores biológicos. Los injertos de nervio no son diferentes de otros injertos biológicos avascularizados. La regeneración del aporte sanguíneo debe ser aportada por los tejidos circundantes para contribuir a la nutrición de los elementos del neurilema. El riesgo de muerte por isquemia de los nuevos elementos formados es elevado en la parte central del injerto, especialmente en estos tejidos poco vascularizados, y puede llevar también a la destrucción de los túbulos de células de Schwann y al fracaso de la regeneración axonal a través del injerto (Zochodne, 2008). Este riesgo de muerte de las células de Schwann es mayor en los trasplantes alogénicos y heterólogos en los que además del aporte vascular deficiente, actúa la respuesta inmune inflamatoria. Es importante señalar que se da una carrera entre la regeneración de los axones cruzando el injerto libre y la destrucción de los túbulos de las células de Schwann.

    En el caso de la interposición de un conducto reabsorbible, no se dan procesos degenerativos en el interior del injerto y no hay una reacción de respuesta inmune sobre el material. El progreso de los axones desde el cabo proximal se realiza sobre el material de relleno del conducto, que sirve como matriz extracelular. En el caso de las prótesis suplementadas con NRG1, tanto el armazón del conducto como su relleno tienen unidas moléculas de NRG1. Estas moléculas son captadas por la superficie celular de las células de Schwann reactivas y estimulan su proliferación y aceleran la migración. La presencia de numerosas células de Schwann en el entorno de la regeneración acumula un gran surtido de factores de crecimiento nerviosos, como NGF, bFGF, BDNF y GDNF. Estos factores promueven el crecimiento axonal. La función acumuladora del conducto es un factor importante en futuras aplicaciones clínicas en la reparación de lesiones de los nervios periféricos.

    La resistencia del alginato para a ser hidrolizado, hace que sea muy duradero en el tiempo, permitiendo que las moléculas que lleve inmovilizadas, en este caso la ß-Neurregulina 1, esté presente en el medio durante largos periodos de tiempo. Por otro lado, la unión débil de dicho factor de crecimiento con el alginato mediante enlaces covalentes o fuerzas iónicas, hace que la simple rutura de esos enlaces libere las moléculas ancladas y que el efecto sea inmediato.

    Las diferencias más significativas entre los grupos experimentales no suplementados y los suplementados con ß-Neurregulina 1, se presentan en las primeras etapas de la recuperación. Este hecho posiblemente sea debido a la lábil unión de la NRG1 a la matriz de alginato. Su efecto es muy pronunciado en las primeras dos semanas postoperatorias.

    Hay un interesante debate respecto a la distancia máxima en la cual la influencia neurotrófica del cabo distal sobre las fibras en regeneración del cabo proximal es efectiva. Esta distancia podría ser tan pequeña como 5 mm en la rata (Longo et al., 1983; Brunelli et al., 1994; Kiyotani et al., 1996; Strauch et al., 1996; Mohanna et al., 2003). Sería necesario el enriquecimiento de los conductos con células de Schwann cultivadas para incrementar la eficacia de los conductos sintéticos. Sin embargo, la supervivencia de las células trasplantadas en el interior del conducto depende de varios factores. En primer lugar es necesaria una rápida y profusa vascularización del implante, ya que el oxígeno es el elemento limitante. Las células no pueden estar más alejadas que unos cientos de micras de un capilar sanguíneo (Sheridan et al., 2000). La completa invasión del conducto por parte de las células de Schwann se conseguiría alrededor del día 60 si se considerasen las tasas de crecimiento axonal y glial que hemos obtenido en nuestros experimentos (0.51 mm/día en prótesis suplementadas con NRG1 durante los primeros 30 días). De esta manera no se considera necesaria la adición de células de Schwann exógenas, ya que la colonización de toda la longitud garantiza la supervivencia de los axones en regeneración. Nosotros hemos observado una total colonización del implante en los supuestos tratados con NRG1. A los 30 días, tan sólo la parte central del conducto queda vacía de elementos celulares y permanece rellena de la matriz de alginato. La buena estructuración de las fibras nerviosas se puede evidenciar por la presencia de multitud de vainas de mielina perfectamente desarrolladas en la porción inicial del conducto. Estas vainas de mielina presentan un mayor grosor en los animales tratados con NRG1. Nosotros hemos podido registrar una ratio G de 0.68 en esta región, muy similar a la ratio normal para un nervio periférico. Este hecho puede deberse a la NRG1 tipo III producida en la superficie de los axones y su relación con el grosor del axón. El mayor grosor del axón se relaciona con una mayor maduración de la regeneración. Esta diferencia entre los grosores de axones y vainas de mielina podría explicarse por la acción de la NRG1 sobre el crecimiento acelerado de los axones en regeneración.

    Con la manipulación del ambiente local de los implantes se han conseguido algunos éxitos en la reparación de espacios pequeños. Sin embargo, hay pocas referencias sobre la acción de los factores neurotróficos en la reparación de grandes lesiones de nervio periférico. La mayoría de los trabajos acerca de la reparación de lesiones pequeñas se ha centrado en la aplicación de un único factor neurotrófico que actuase específicamente sobre las neuronas o sus prolongaciones (Withworth et al., 1995b; Sterne et al., 1997; Tham et al., 1997). Sin embargo, la utilización de la ß-Neurregulina 1 como factor de crecimiento exógeno y que actúa directamente sobre las células de Schwann, desencadenaría todo un espectro de mecanismos que podrían indirectamente estimular la regeneración del nervio periférico. En nuestro caso la ß-NRG1 de tipo I fue el único factor de crecimiento añadido al medio de cultivo, eliminando la posibilidad de una interferencia en los resultados por parte de otros factores de crecimiento. La NRG1 estimula la proliferación de las células de Schwann (de la Fuente et al., 2012) e induce la liberación de varios factores neurotróficos desde las células gliales, que a su vez activan las rutas de supervivencia e incrementan la síntesis de proteínas y la proliferación en las neuronas (Terenghi, 1999). Tras la axotomía, la regeneración axonal y la de las células de Schwann desde el cabo proximal progresan normalmente a una velocidad similar (Jessen y Mirsky, 1998). Esto se demuestra por la similar distancia de la regeneración axonal y de las células de Schwann que hemos encontrado. En los implantes con NRG de 15 días de superviviencia, los axones habían colonizado 5.83 mm de longitud del conducto mientras que en los no suplementados tan sólo fue de 4.24 mm. Estas distancias son coincidentes con la distancia recorrida por las células de Schwann. La cantidad de células de Schwann regeneradas era notablemente mayor en los implantes con NRG1 cuando se comparaban con los individuos no tratados. La adición de NRG1 también aumentó paralelamente la cantidad de axones regenerados. Aunque la adición de NRG1 produjo el incremento más importante en la cantidad de células de Schwann y de axones en regeneración a los 15 días se pudieron observar los efectos hasta los 75 días como se demostró por la presencia de estructuras mielinizadas estables (ratio G = 0.68) en el interior del conducto.

    Cuando se insertan implantes acelulares de tejido nervioso central o periférico en secciones de nervio periférico, las células de Schwann vivas del receptor migran dentro del implante (Anderson y Turmaine, 1986; Ide et al., 1983). Cuando los axones crecen en tubos vacíos sin lámina basal, tienden a hacer contacto con la superficie de células vivas, como células de Schwann u otros axones (Ide et al., 1983; Schwab y Thoenen, 1985). En nuestras muestras de microscopía electrónica de transmisión hemos observado mayoritariamente que las neuritas crecen sobre las láminas basales producidas por las células de Schwann, si bien, en alguna ocasión hemos caracterizado varios procesos axonales de pequeño calibre creciendo directamente sobre la superficie de una célula de Schwann o en contacto directo con otros axones (ver figura 41). El espacio intercelular tiende a ser ocupado por matriz extracelular en forma de capas superpuestas de fibras de colágeno, desplazando rápidamente al alginato. Las células de Schwann sintetizan matriz extracelular sólo tras el contacto con la neurona (Bunge et al., 1986). En ningún caso hemos observado procesos axonales creciendo directamente sobre el alginato.

    Las células de Schwann parecen tener un sentido del ritmo y la coordinación de los productos que sintetizan. Aunque el mecanismo exacto no está claro, hay evidencias de que las células de Schwann evalúan su medio ambiente local y responden en consecuencia (Zochodne, 2008). Además, hay una íntima comunicación bidireccional entre el axón y la célula de Schwann. La molécula mediante la que se comunican es la NRG1. Esta comunicación es crucial durante la regeneración pero también está presente en los troncos nerviosos sanos (Fricker y Bennett, 2011).

    Las células de Schwann asociadas a axones mielinizados no expresan factor de crecimiento nervioso (NGF). Si pierden el contacto con el axón, comienzan a expresar el receptor de NGF de baja afinidad p75 en sus superficies, y producen NGF (Taniuchi et al., 1988). Cuando tiene lugar la regeneración y el contacto con el axón se ha restablecido, las células de Schwann dejan de producir NGF y el receptor p75 de baja afinidad de NGF (Taniuchi et al., 1988; Bradley et al., 1998). Estas referencias coinciden con los datos observados durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral, sin embargo, hemos podido comprobar que en los injertos suplementados con NRG1 la expresión de p75NTR es detectable en células de Schwann y células perineurales hasta la cota de los 75 días. La estimulación con NRG1 de las células de Schwann durante las primeras etapas de la regeneración parece favorecer la presencia de p75NTR en su superficie durante largos periodos de tiempo. De esta manera, las células de Schwann mantendrían su capacidad para acumular NGF en su superficie, multiplicando así su disponibilidad para nuevos axones en regeneración. Estos elementos p75NTR+ se observan en regiones colonizadas por células de Schwann con fuerte expresión de proteína S100. Muchas de las CS presentes en el extremo distal del injerto tratado con NRG1 después de 75 días, presentan ambos marcadores. En estas preparaciones, las células de Schwann están involucradas activamente en la mielinización de los axones (expresando moléculas propias de CS mielinizantes maduras, como MBP, S100 o la proteína P0) y, paralelamente, acumulan neurotrofinas en su superficie para estimular la asociación de nuevos axones.

    La presencia de receptores de neurotrofinas en el nervio periférico seccionado es un requisito previo para la respuesta mediada por neurotrofinas. La presencia de ARNm de p75NTR y de inmunorreactividad para esta proteína aumentan en el extremo distal de la lesión. Después del contacto axonal durante la regeneración, la expresión de p75NTR en las células de Schwann es reducida a los niveles observados en el nervio sano (Taniuchi et al., 1988; Funakoshi et al., 1993). La inducción de expresión de p75NTR después de la axotomía se ha propuesto como mecanismo de concentración de NGF en la superficie de las células de Schwann, anclando el ligando y estimulando la regeneración nerviosa (Taniuchi et al., 1988). El axón podría ejercer algún control sobre la expresión de la S100 en las células de Schwann (Stefansson et al., 1982a). Este mismo fenómeno lo hemos observado tras la sección del nervio. Hemos observado que es más acentuado en los casos en los que hemos tratado el conducto con NRG1. La explicación de este acentuamiento podría ser que la NRG1 presente en el medio mantiene a las células de Schwann en un fenotipo muy cercano al de célula de la Schwann inmadura, cuya expresión de proteína S100 es significativamente menor. En el ser humano se ha demostrado que la compresión de un nervio o su sección modifica la expresión de la proteína S100 en los corpúsculos de Meissner. La inmunorreactividad persiste tan sólo a niveles residuales (Marquez et al., 1997; Albuerne et al., 1998; Lopez et al., 1998). Nosotros pensamos que a medida que la relación entre el axón y la célula de Schwann se estabiliza, la expresión de proteína S100 se ve aumentada hasta los niveles normales de una célula de Schwann madura. Este hecho coincide con las células de Schwann S100+ encontradas en secciones seriadas correspondientes a áreas en las que hemos observado axones mielinizados. Además, en los animales a los que se les implantaron prótesis suplementadas con NRG1, el aumento de expresión de S100 no implica una desaparición total de las células p75NTR+; en estos animales encontramos una etapa en la asociación célula de Schwann ¿ axón en la que coexisten ambos marcadores.

    CONCLUSIONES 1. Una prótesis de PLGA con doble envoltura exterior y un andamiaje interno compuesta por dos láminas perpendiculares es adecuada para posibilitar la regeneración nerviosa en una neurectomía de 30 mm, sin la necesidad de añadir elementos celulares exógenos.

    2. El alginato de sodio es un biomaterial adecuado para inmovilizar moléculas bioactivas, como la NRG1, y liberarlas gradualmente, aunque sus características no favorecen la adhesión y avance de las CS y de los axones.

    3. La velocidad de la regeneración a través de la prótesis acelulares con NRG1 es suficiente para la correcta mielinización de las fibras nerviosas durante la reparación de lesiones de 30 mm.

    4. La NRG1 es un factor de crecimiento eficaz para ejercer un fuerte efecto sobre la proliferación y la migración de las células de Schwann en los primeros días de la reparación con una prótesis bioabsorbible acelular. Además, tiene un efecto a largo plazo sobre las células de Schwann favoreciendo su plasticidad.

    5. El fenotipo de las células de Schwann está determinado por el modo de asociación al axón y por la exposición a NRG1. De esta manera, en las zonas de lesión reciente se reduce la expresión de S100 en las CS, mientras que aumenta la de p75NTR y las capacidades de proliferación y migración. Cuando la asociación entre un axón y una célula de Schwann se vuelve estable y se da la milelinización, se recupera la expresión de S100 y disminuye p75NTR. La exposición a NRG1 provoca que la presencia de p75NTR sea abundante en células de Schwann, 75 días después del implante. Estos elementos se observan en regiones colonizadas por células de Schwann con fuerte expresión de proteína S100.

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