Caracterización de los mecanismos regulatorios que establecen los patrones de desarrollo de las raíces laterales y células madre radiculares en arabidopsis thaliana

• Autores: Alvaro Sánchez
• Directores de la Tesis: Miguel Ángel Moreno Risueño (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Politécnica de Madrid ( España ) en 2021
• Idioma: español
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• Resumen

  • Las plantas tienen la capacidad de crecer durante toda su vida generando de forma continua órganos y tejidos, proceso que requiere la especificación de nuevas células madre (adquisición del destino celular), así como el mantenimiento y proliferación de dichos órganos y tejidos. A pesar de que se han realizado grandes progresos en el conocimiento de la regulación molecular de las células madre, numerosos aspectos permanecen desconocidos. Las células madre del meristemo apical radicular (RAM), conocidas como nicho de células madre (SCN), han sido las más estudiadas. Por el contrario, el conocimiento de la regulación que rige la especificación de las células madre de la raíz lateral, y su división para generar un nuevo órgano, es desconocido. Por lo tanto, las dos líneas de investigación principales de la presente tesis doctoral han sido: primero, profundizar en los mecanismos moleculares que rigen el mantenimiento y especificación de las células madre del RAM, y segundo, identificar transcriptomas de tipo celular en los estadios iniciales de la organogénesis de la raíz lateral.

    Para el desarrollo de la primera línea de investigación, se estudió la regulación ejercida por BLUEJAY (BLJ), JACKDAW (JKD) y SACARECROW (SCR) en el mantenimiento del RAM, y especificación de novo del SCN del RAM. En el mantenimiento de la actividad del RAM, se siguieron tres aproximaciones. Por un lado, mediante el análisis del crecimiento y mantenimiento de la actividad meristemática, se identificó que el triple mutante de pérdida de función para BLJ, JKD y SCR, blj jkd4 scr4, tiene afectada la capacidad de mantenimiento del mismo lo que conduce a una diferenciación prematura. En este sentido, y dado que el mantenimiento del SCN reside en las células quiescentes, denominadas como células del centro quiescente (QC), se ha comprobado que BLJ, JKD y SCR se requieren para el correcto funcionamiento de las células del QC. Al profundizar en las causas moleculares de la disfunción meristemática, se ha puesto en evidencia que BLJ, JKD y SCR regulan de forma conjunta y no autónoma, particularmente desde el tejido basal o “ground tissue” (GT), los niveles de las proteínas de los reguladores maestros SHORT-ROOT (SHR) y PLETHORA (PLT), que coordinan las vías de señalización longitudinal (mediada por auxinas/PLT) y radial (mediada por SHR / SCR) para así mantener la funcionalidad meristemática. De forma adicional, mediante el análisis de datos transcriptómicos se identificaron 15 genes como potenciales reguladores meristemáticos, de los cuales 3 se mueven desde el GT hacia el meristemo y son: DUO1-ACTIVATED ZINC FINGER 3 (DAZ3), NUCLEAR FACTOR Y SUBUNIT B5 (NF-YB5) y C-REPEAT BINDING FACTOR 3 (CBF3). De esos tres, se comprobó que la proteína de CBF3 se mueve desde el GT, regula la actividad meristemática y se expresa aguas abajo de BLJ, JKD y SCR. En la regulación molecular ejercida por CBF3, se comprobó que actúa reprimiendo la diferenciación, y que regula los niveles de las proteínas SHR y PLT2. De esta forma, se integra la señalización longitudinal, mediada por auxinas/PLT, y radial, mediada por SHR/SCR, desde el GT a través del factor de transcripción móvil CBF3. En la regulación de la especificación de un nuevo SCN, se siguió la aproximación de la ablación por láser de las células del SCN sin dañar el QC para estudiar la regeneración. Esta aproximación ha permitido identificar que BLJ, JKD y SCR son necesarios para la especificación de novo de un SCN durante la regeneración. Además, al complementar a blj jkd4 scr4 con la proteína de CBF3, expresada en el GT, y realizar la ablación por láser, se ha observado que el triple mutante complementado es capaz de regenerar. Al profundizar en la regulación molecular de CBF3 durante la regeneración del SCN, se ha comprobado que está regulando la especificación y el posicionamiento celular durante la regeneración. De esta forma, se pone de manifiesto que BLJ, JKD y SCR parecen regular la regeneración del SCN a través de CBF3.

    Para el desarrollo de la segunda línea de investigación, se siguieron dos aproximaciones. Por un lado, se generaron y caracterizaron varios marcadores específicos de tipo celular en las transiciones iniciales del desarrollo de la raíz lateral y por otro se procedió a su análisis transcriptómico y bioinformático. Además, se observó que se podía ajustar el tiempo de crecimiento para cada marcador, que correspondía con la presencia de tipos celulares únicos. El marcador pSKP2B0.5 se expresa desde momentos anteriores a la especificación de las fundadoras de la raíz lateral (LRFC) hasta la aparición de las células hijas de las LRFC. La expresión del marcador pHB532k comienza en la migración nuclear de las LRFC, lo que permite caracterizar a las LRFC en diferentes momentos en la adquisición del destino celular de células madre. Con el marcador doble, denominado pHB53w-pWOX5, se han podido caracterizar las células hijas pequeñas, generadas tras la división asimétrica de las LRFC, en diferentes momentos del desarrollo previos al estadio II. En efecto, se ha comprobado que pHB53w se expresa sólo en las células hijas pequeñas, y la expresión de pWOX5 se restringe a un subgrupo dentro de las mismas. Esto ha permitido caracterizar el establecimiento del QC (o sus células precursoras) durante el estadio I, que se ha denominado estadio I-A. Este resultado pone en evidencia que la aparición de WOX5 está ligada con el tiempo de desarrollo y no con la división celular. El marcador fluorescente doble pSCR-pWOX5, ha permitido comprobar que la expresión de pSCR aparece tras la división longitudinal de las células hijas, en la capa más externa el primordio, y la de pWOX5 que abarca el grupo de células hijas pequeñas internas y externas. Además, se han caracterizado picos en la señalización por auxinas, mediante pDR5, en diferentes momentos del desarrollo de la raíz lateral. La caracterización de diferentes tipos celulares, y el ajuste del tiempo de crecimiento, ha permitido aislar cada tipo celular mediante citometría de flujo acoplada a fluorescencia o “Fluorescent Activated Cell Sorting” (FACS), para a continuación proceder a la secuenciación masiva de sus ARN mensajeros, y su análisis bioinformático. De esta forma, se ha podido identificar el programa transcripcional de momentos clave del desarrollo de la raíz lateral, periciclo, LRFC y sus hijas. Además, mediante el análisis de la expresión génica y el cálculo del índice de identidad celular o “Index of Cell Identity” (ICI), se ha comprobado que la identidad celular de QC se establece en el denominado estadio I-A, revelándose la existencia de nuevas identidades celulares. Por otro lado, el análisis de los genes diferencialmente regulados ha permitido establecer dos redes regulatorias genéticas en la organogénesis de la raíz lateral, una desde el periciclo hasta las células hijas grandes y otra desde el periciclo hasta las células hijas pequeñas en estadio II. Finalmente, se han podido identificar nuevos reguladores en la organogénesis post-embrionaria de la raíz lateral como es el factor de transcripción HB53.