Resumen de Genetic and biochemical approaches to decipher the molecular basis of the pathology in lca12 and rp10 retinal dystrophies
The main aim of this work was to characterize the molecular mechanisms that underlie the physiopathology of LCA12 and RP10, that are inherited retinal dystrophies caused by alterations in guanine nucleotide metabolism.
First, LCA12 is caused by loss-of-function mutations in the retinal degeneration 3 (RD3) gene, that impair rod and cone function and cause a fast retinal degeneration in patients. This disease is reproduced in the natural strain of rd3 mice. The underlying physiopathology mechanisms of LCA12 are not well understood. We previously proposed that Guanylate Cyclase Activating Proteins (GCAPs) might be key Ca2+-sensors mediating the physiopathology of this disorder, based on the demonstrated toxicity of GCAP2 when blocked in its Ca2+-free form at photoreceptor inner segments. We here show that the retinal degeneration in rd3 mice is substantially delayed by GCAPs ablation. While the number of retinal photoreceptor cells is halved in six weeks in rd3 mice, it takes eight months to halve in rd3/rd3 GCAPs-/- mice. Although this substantial morphological rescue does not correlate with recovery of visual function due to very diminished guanylate cyclase activity in rd3 mice, it is very informative of the mechanisms underlying photoreceptor cell death. By showing that GCAP2 is mostly in its Ca2+-free phosphorylated state in rd3 mice, we infer that the [Ca2+]i at rod inner segments is permanently low. GCAPs are therefore retained at the inner segments in their Ca2+-free, guanylate-cyclase-activator state. We show that in this conformational state GCAPs induce endoplasmic reticulum stress, mitochondrial swelling and cell death. ER stress and mitochondrial swelling are early hallmarks of rd3 retinas preceding photoreceptor cell death, that are substantially rescued by GCAPs ablation. By revealing the involvement of GCAPs-induced ER stress in the physiopathology of LCA12 this work will aid to guide novel therapies to preserve retinal integrity in LCA12 patients to expand the window for gene therapy intervention to restore vision.
Second, RP10 is caused by gain-of-function mutations in IMPDH1 gene. Inosine-5´-monophosphate dehydrogenase 1 (IMPDH1) catalyzes the rate-limiting step in the de novo synthesis of guanine nucleotides, impacting the cellular pools of GMP, GDP and GTP. Guanine nucleotide homeostasis is central to photoreceptor cells of the retina, where cGMP is the signal transducing molecule in the light response. Mutations in IMPDH1 lead to inherited blindness, but the physiological relevance of IMPDH1 in the retina or its in vivo regulation remain largely unknown. We here investigate the in vivo regulation and physiological relevance of IMPDH1 in the retina, to gain insight into how IMPDH1 mutations lead to retinal dystrophies. We here report that retinal IMPDH1 in vivo is regulated by light-dependent phosphorylation at Thr159/Ser160 in the Bateman domain by protein kinase C, that desensitizes the enzyme to allosteric inhibition by GDP/GTP. The projected enhancement in guanine nucleotide synthesis would contribute to sustain the GTP levels during illumination. Accordingly, we show that living mice accumulate IMPDH1 aggregates at rod outer segments upon prolonged bright light exposure; and that inhibiting IMPDH1 activity in living mice by intravitreal injection of IMPDH1 inhibitors delays rod mass response recovery. Based on these results we propose a novel mechanism of in vivo regulation of IMPDH1 that when disrupted leads to blindness.
El principal objetivo del presente estudio fue caracterizar los mecanismos moleculares responsables de las distrofias hereditarias de la retina LCA12 y RP10, ambas causadas por alteraciones en el metabolismo de nucleótidos de guanina.
Primero, la patología LCA12 se debe a mutaciones de pérdida de función en el gen RD3 (retinal degeneration 3), que impidien la función de conos y bastones y causan una degeneración de la retina muy rápida. Esta enfermedad se reproduce de forma natural en una cepa de ratón, el ratón rd3. Los mecanismos fisiopatológicos que median esta enfermedad se desconocen. Previamente propusimos que las proteínas sensoras de calcio GCAPs (Guanylate Cyclase Activating Proteins) podrían mediar la fisiopatología en este desorden, basándonos en la toxicidad que ejerce GCAP2 cuándo se encuentra bloqueada en su forma libre de Ca2+ en los compartimentos internos de los fotoreceptores. En el presente estudio vemos que la degeneración retinal en el ratón rd3 se ve substancialmente reducida cuándo eliminamos las proteínas GCAPs. Mientras que el numero de células fotoreceptoras en el ratón rd3 se reduce a la mitad en tan solo seis semanas, son necesarios ocho meses para ver esa misma reducción en los ratones rd3/rd3 GCAPs-/-. Aunque este rescate morfológico es substancial, esta recuperación no correlaciona con una mejora de la función visual. Aún así, este rescate es muy informativo de los mecanismos que llevan a la muerte de los fotoreceptores en este contexto. Al ver que GCAP2 estaba principalmente en su forma libre de Ca2+ y fosforilada, inferimos que la concentración de Ca2+ es permanentemente baja en los compartimentos internos del fotoreceptor. Entonces, en ausencia de RD3, las GCAPs se encuentran retenidas en las compartimentos internos del fotoreceptor en su forma libre de Ca2+, su estado “activador”. Vimos que en éste estado conformacional las GCAPs inducen estrés en el retículo endoplásmico, disrupción de mitocondrias y muerte celular. Todos estos signos se vieron substancialmente reducidos cuándo eliminamos las proteínas GCAPs en los ratones rd3. Revelando el efecto de las GCAPs en el retículo endoplásmico en la fisiopatología LCA12, éste trabajo ayudará a guiar nuevas terapias para preservar la integridad de la retina en pacientes con LCA12 y así expandir la ventana de tiempo para futuras terapias génicas.
Segundo, RP10 es causada por mutaciones de pérdida de función en el gen IMPDH1. IMPDH1 (Inosine-5´-monophosphate dehydrogenase 1) cataliza el paso limitante en la síntesis de novo de nucleótidos de guanina, impactando en el contenido celular de GMP, GDP y GTP. La homeostasis de los nucleótidos de guanina es fundamental en las células fotoreceptoras de la retina, dónde el cGMP constituye el segundo mensajero en la respuesta a la luz. Mutaciones en IMPDH1 llevan a ceguera hereditaria, pero la relevancia fisiológica de IMPDH1 en la retina y su regulación in vivo aún se desconocen. En éste trabajo hemos investigado la regulación in vivo y la relevancia fisiológica de IMPDH1 en la retina. Hemos visto que IMPDH1 se regula in vivo a través de una fosforilación mediada por PKC en respuesta a la luz. La fosforilación se da en la Thr159/Ser160 en el dominio regulador de IMPDH1 (Bateman domain) y su efecto es desensibilizar la inhibición alostérica por producto GDP/GTP. El aumento en la síntesis de nucleótidos de guanina podría contribuir a mantener los niveles de GTP durante la respuesta a la luz. De acuerdo con esto, vemos que ratones expuestos a una luz prolongada presentan acumulaciones de IMPDH1 en el compartimento sensorial. Vemos, también, que la inhibición de IMPDH1 mediante inyecciones intravítreas reduce el tiempo de recuperación en los bastones en respuesta a la luz. En base a estos resultados proponemos un nuevo modelo de regulación in vivo de IMPDH1 que cuándo se ve alterado lleva a ceguera.
