Resumen de Desenvolupament d'una vacuna contra la mamitis bovina causada per streptococcus uberis
La mamitis bovina causada per Streptococcus uberis és un problema de gran importància en les explotacions lleteres bovines a nivell mundial i en l’actualitat no existeix cap vacuna comercial que hagi demostrat ser eficaç per combatre aquesta patologia. Els objectius de la present tesi doctoral s’emmarquen en les fases 1 i 2 del procés de desenvolupament d’una nova vacuna contra la mamitis bovina causada per S. uberis.
El primer objectiu va consistir en el desenvolupament d’un model d’infecció intamamaria capaç de reproduir la patologia en vaques en lactació, amb la finalitat d’utilitzar-lo en posteriors estudis d’eficàcia amb vacunes experimentals formulades amb els candidats vacunals obtinguts com a resultat d’aquest treball. Les proves per desenvolupar aquest model d’infecció van començar aconseguint aïllats de casos clínics de mamitis bovina i caracteritzant in vitro la seva cinètica de creixement i la seva capacitat de formació de biofilm en placa de 96 pous. En base a aquests resultats inicials, es van seleccionar dues soques i es van infectar experimentalment per via intramamària 2 grups de 4 vaques, amb la mateixa dosi de totes dues soques i en un únic quarteró per vaca. Després de la infecció experimental, es van monitoritzar els signes clínics de mamitis, el recompte de cèl·lules somàtiques (RCS) i el recompte bacteriològic dels quarterons infectats durant 16 dies, així com la producció de llet de les vaques. Els resultats van mostrar diferències clares en la patogenicitat d’ambdues soques, suggerint que la diferent habilitat de formació de biofilm de les soques pot conferir una estratègia de colonització i persistència diferent a la glàndula mamària. Aquests resultats van servir per seleccionar la dosi i la soca d’infecció per les posterios proves d’eficàcia en vaques dels candidats vacunals obtinguts en aquesta tesi doctoral.
Per altra banda, degut a la manca d’estudis publicats sobre candidats vacunals eficaços contra la mamitis bovina causada per S. uberis, el següent objectiu d’aquesta tesi va consistir en la recerca de nous antígens vacunals. Amb aquesta finalitat, es van seguir dues línies de treball per cercar antígens relacionats amb la formació de biofilm d’S. uberis, un factor de virulència que ja havia estat descrit com a rellevant en la mamitis causada per altres patògens (Gomes, Saavedra, & Henriques, 2016). La primera consistia en la identificació de proteïnes immunògenes associades a la paret cel·lular de S. uberis quan aquest creix formant biofilm. La segona línia de treball, es va centrar en l’estudi de components no proteics associats a la formació de biofilm de S. uberis.
En la primera aproximació, es van utilitzar sèrums de conills immunitzats amb biofilm de S. uberis i un sèrum d’una vaca infectada per S. uberis, per detectar proteïnes immunògenes associades a la paret cel·lular bacteriana. Els resultats van permetre identificar un total de 18 proteïnes immunògenes candidates a ser introduïdes en una vacuna.
D’aquestes 18 proteïnes, 3 van ser seleccionades per haver estat descrites prèviament com a factors de virulència en altres patògens: la gliceraldehid-3-fosfat deshidrogenasa (GAPDH), la fructosa bisfosfat aldolasa (FBA) i el factor d’elongació Ts (EF-Ts). Posteriorment, diferents grups de ratolins van ser immunitzats amb aquestes proteïnes expressades de manera recombinant i seguidament infectats per via intraperitoneal amb una soca virulenta de S. uberis. Les 3 proteïnes van induir anticossos immunoglobulines G (IgG) en ratolins, però només la FBA i el EF-Ts van reduir la mortalitat dels ratolins després de la infecció experimental, en comparació a un grup control no-vacunat i infectat.
En la segona aproximació, es va treballar en l’extracció i caracterització de components no proteics associats al biofilm de S. uberis.
El protocol d’extracció es va desenvolupar en base a estudis previs sobre ’extracció de polisacàrids capsulars i exopolisacàrids de la matriu del biofilm de Staphylococcus aureus mitjançant un tractament tèrmic (Pérez et al., 2009; Prenafeta, March, Foix, Casals, & Costa, 2010). En la caracterització de l’extracte soluble obtingut es va identificar l’àcid lipoteicoic (LTA), descrit a la literatura com un possible factor de virulència de microorganismes Gram positius. En aquesta tesi, per primer cop, es va aconseguir demostrar la seva implicació en la formació de biofilm de S. uberis in vitro.
Finalment, com a últim objectiu d’aquest treball, es va avaluar l’eficàcia dels candidats vacunals seleccionats ens les dues aproximacions anteriors, en el model d’infecció intramamaria en vaques en lactació desenvolupat prèviament. Si bé les proteïnes recombinants FBA i EF-Ts van ser seleccionades per mostrar una eficàcia parcial en el model murí, una vacuna experimental formulada amb les dues proteïnes no va resultar eficaç en front a una infecció experimental en vaques amb una soca virulenta de S. uberis (dades no incloses en aquesta tesi). A continuació, es va realitzar un segon estudi d’eficàcia amb una vacuna formulada amb l’LTA extret del biofilm d’ S. uberis. Aquesta prova va consistir en 2 grups de vaques gestants. El primer grup es va vacunar amb dues dosis de la vacuna administrades 60 i 21 dies abans del part i el segon grup amb dues dosis de tampó fosfat salí (PBS) com a grup control. Catorze dies després del part, totes les vaques van ser infectades experimentalment amb una soca virulenta de S. uberis. A continuació, es van monitoritzar durant 21 dies els signes clínics de mamitis, el RCS i el recompte bacteriològic dels quarterons infectats, així com la temperatura rectal i la producció de llet de totes les vaques. Els resultats obtinguts van demostrar que, malgrat tots els quarterons infectats van desenvolupar manifestacions clíniques de la patologia, les vaques vacunades van presentar menys signes clínics de mamitis i un menor recompte bacteriològic en els quarterons infectats. A més, després de la infecció experimental, les vaques vacunades van exhibir menor temperatura rectal i menys pèrdues en la producció de llet que les vaques control. Finalment, cal destacar que al final de l’estudi, les vaques vacunades van presentar un major percentatge de quarterons sans, definits com quarterons sense recompte bacteriològic i amb RCS < 200.000 cèl·lules/mil·lilitre (cels/mL), que les vaques control. Així doncs, els resultats d’aquesta prova van confirmar l’eficàcia d’una vacuna experimental basada en un extracte que contenia LTA, davant d’una infecció experimental en vaques en lactació. Per tant, el desenvolupament d’aquesta vacuna va prosseguir, ja fora del marc d’aquesta tesi doctoral, amb els estudis necessaris per complir els requeriments regulatoris pel seu registre i comercialització.
