Estudio y optimización de la capacitación in vitro de espermatozoides de ciervo ibérico (cervus elaphus hispanicus))
- Autores: María Iniesta Cuerda
- Directores de la Tesis: Ana Josefa Soler Valls (dir. tes.), Julián Garde López-Brea (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Castilla-La Mancha ( España ) en 2020
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Julián Santiago Moreno (presid.), María del Rocío Fernández Santos (secret.), Andrea Cestari (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Ciencias Agrarias y Ambientales por la Universidad de Castilla-La Mancha
- Materias:
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- Resumen
La cría en cautividad de ciervos, aunque excepcional en la mayoría de las partes del mundo, es una actividad económica próspera. Las biotecnologías reproductivas representan herramientas de gran utilidad que permitirían la expansión de este sector ganadero. Técnicas como la producción in vitro de embriones (del inglés in vitro embryo production, IVEP) es una de ellas, sin embargo, en esta especie, carece de un nivel de desarrollo suficiente como para permitir establecer una infraestructura comercial de producción, venta y transferencia de embriones con la que los ganaderos puedan contar. Uno de los principales motivos que impide el desarrollo de la técnica en ciervos es la escasez de conocimiento acerca de la fisiología de los espermatozoides. Concretamente, la información disponible acerca de la fase de capacitación espermática, mediante la cual los espermatozoides adquieren la habilidad de fecundar los ovocitos, es confusa y insuficiente, debido sustancialmente a que los trabajos en ciervo son inusuales. Asimismo, como consecuencia del conocimiento limitado en este campo concreto de la fisiología espermática de esta especie, sustancias indefinidas e inconsistentes como el suero de oveja en celo (del inglés estrus sheep serum, ESS) siguen siendo utilizadas como agentes capacitantes en las rutinas de fecundación in vitro (FIV) impidiendo la estandarización y uso más amplio de esta tecnología. Los trabajos llevados a cabo para la redacción de esta Tesis Doctoral surgen con la idea de mejorar los protocolos de capacitación implementados en la IVEP de ciervo mediante el estudio de la fisiología espermática durante esta fase y con la intención de desarrollar un medio de capacitación lo más definido posible para producir in vitro embriones. De esta manera, se han llevado a cabo cuatro experimentos para (1) demostrar que, el ESS, a pesar de ser un potente agente capacitante y permitir la FIV en estas especies, presenta una variabilidad que podría estar alterando el proceso de capacitación y otras funciones espermáticas así como la producción y calidad de los embriones producidos; (2) evaluar cómo evolucionan los espermatozoides durante una incubación de 24 h en presencia de ESS con la intención de determinar el tiempo idóneo para capacitar a los espermatozoides descongelados de ciervo ibérico; (3) definir un medio libre de ESS para capacitar espermatozoides de ciervo ibérico empleando BSA como remplazo; y (4) estudiar el efecto del calcio y el bicarbonato, dos compuestos esenciales para el proceso, sobre los espermatozoides para definir su concentración en el medio de capacitación sin ESS.
Con el primer experimento quisimos comprobar si la variabilidad existente entre distintos lotes de ESS tenía repercusión sobre la funcionalidad espermática, así como sobre los resultados de capacitación y embriones producidos usando como modelo la especie ovina. De esta manera evidenciamos la necesidad de eliminar el ESS de los medios de capacitación y fecundación pues, el uso de diferentes lotes produce distintos niveles de fosforilación en tirosina siendo algunos incapaces de promover el incremento de ésta que está asociado a la capacitación espermática. Por el contrario, vimos el efecto reducido que tiene la variabilidad de los ESS sobre la producción y calidad embrionaria.
En el segundo experimento, diversos parámetros relacionados con la funcionalidad espermática como la motilidad, viabilidad, condición del acrosoma, actividad mitocondrial, cantidad de especies reactivas de oxígeno (del inglés reactive oxygen species ROS) o estado de la cromatina, así como la fosforilación de tirosina, fueron estudiados abarcando, desde tiempos de incubación de 1 min, a tiempos largos de 24 h. Esto permitió hacer una radiografía bastante fiel del potencial fecundante de la muestra a lo largo del tiempo y observamos que incubaciones superiores a los 30 min redujeron la funcionalidad de los espermatozoides afectando negativamente a todos los parámetros mencionados a excepción de los ROS, que se mantuvieron relativamente constantes. Además, los resultados de la técnica de FIV corroboraron que las tasas de división de ovocitos fueron menores cuando las incubaciones de los espermatozoides superaron los 30 min. De forma destacada, nuestros resultados mostraron también un incremento progresivo en la descondensación de la cromatina de los espermatozoides durante la primera parte de la incubación (t<30 min), que interesantemente coincidió con el periodo en el que los procesos asociados a la capacitación y fecundación fueron mayores.
En el tercer experimento comenzamos el diseño de un medio libre de ESS para ser implementado en los protocolos de capacitación de la IVEP de ciervos. Para ello utilizamos la albúmina sérica bovina (del inglés bovine serum albumin, BSA) como fuente proteica del medio de capacitación en sustitución del ESS. Este experimento nos demostró que la BSA es eficaz como remplazo del ESS en los medios de capacitación al ofrecer a los espermatozoides un ambiente comparable al ESS protegiéndolos de manera similar de las ROS. Además, los resultados obtenidos sugirieron que, en ausencia de ESS, para que el medio de capacitación sea capaz de promover adecuadamente la capacitación espermática, es necesaria la correcta estimulación de la via de señalización del AMP cíclico por parte del calcio y del bicarbonato.
En el cuarto y último experimento evaluamos distintas concentraciones de calcio y bicarbonato para determinar aquella que mejor se ajustase a las necesidades propias de los espermatozoides de ciervo. Tras esto, evaluamos qué valor de pH del medio propuesto podría ser más idóneo para desatar las modificaciones que se asocian a la capacitación y para mantener la funcionalidad de los espermatozoides. De esta manera observamos que un fluido oviductal sintético formulado con 3 mg/mL de BSA, 3 mM de calcio y 30 mM de bicarbonato con un pH 7 desencadenó cambios relacionados con la capacitación espermática por encima de los observados en los espermatozoides incubados con ESS. No obstante, este medio para la capacitación in vitro de espermatozoides de ciervo requiere de mejoras pues su uso durante la técnica de FIV no permitió alcanzar las mismas tasas de fecundación que las obtenidas con el ESS.
