Resumen de Aplicación de la espectrometría de masas por maldi-tof para la identificación de especies del género mycobacterium
Actualmente, la tuberculosis sigue siendo uno de los mayores problemas de salud en el mundo, con una estimación de 1,4 millones de muertes anuales y de 10 millones de nuevos casos cada año. Por otro lado, las micobacterias no tuberculosas (MNT) están ganando protagonismo en los países con una baja prevalencia de tuberculosis, llegando a representar hasta un 50% o más del total de micobacterias aisladas en los laboratorios de microbiología clínica. Las MNT se encuentran ampliamente distribuidas en el ambiente y una parte de ellas puede llegar a causar infecciones pulmonares y extrapulmonares, así como infecciones diseminadas en pacientes inmunodeprimidos. Debido a la gran diversidad de MNT que existen (más de 190 especies), el diagnóstico microbiológico es un auténtico reto. La identificación convencional basada en pruebas fenotípicas ha quedado en desuso ya que requiere largos períodos de tiempo y no es capaz de distinguir muchas de las nuevas especies descritas. Actualmente se utilizan técnicas moleculares fundamentalmente basadas en una PCR e hibridación reversa y/o secuenciación de determinadas dianas. A pesar de su alta fiabilidad, son métodos costosos, que requieren una infraestructura específica, y las más utilizadas, como son los métodos comerciales de PCR-hibridación reversa, alcanzan a identificar un número limitado de especies micobacterianas. La aparición del MALDI-TOF MS ha supuesto un gran revulsivo en el diagnóstico microbiológico, demostrando ser un método rápido, de bajo coste y fiable para la identificación de bacterias convencionales y levaduras. Sin embargo, en el campo de las micobacterias presenta aún algunos desafíos. Ello es debido principalmente a la complejidad de la pared celular de estos microorganismos, que dificulta, entre otras cosas, una adecuada extracción proteica, lo cual es fundamental para lograr una identificación exitosa. El objetivo de esta tesis fue evaluar de una forma global la aplicación de la técnica del MALDI-TOF MS para la identificación de las diversas especies del género Mycobacterium. Para ello, los distintos estudios llevados a cabo se centraron en los aspectos clave o críticos que pueden en mayor o menor medida influir en la eficacia de éste sistema sobre los aislamientos micobacterianos clínicos obtenidos en el laboratorio de microbiología. En un primer estudio, se evaluó la importancia de la actualización de las bases de datos comerciales de micobacterias del sistema MALDI Biotyper (Bruker Daltonics). Así, se pudo observar que hay dos factores fundamentales que tienen un gran impacto en el incremento del número de aislamientos identificados con éxito por el MALDI-TOF MS: por un lado, la incorporación de nuevas especies a la base de datos y, por otro lado, el aumento en el número de espectros proteicos incluidos de todas ellas. Posteriormente, se estudiaron diversos procedimientos de extracción proteica de los aislamientos, que constituye uno de los puntos más críticos en la identificación micobacteriana por el MALDI-TOF MS. Así, se analizaron dos variantes de un procedimiento basado en la aplicación de un ciclo de congelación y de agitación mecánica mediante un homogeneizador. Ambos métodos diferían en el tiempo y la temperatura utilizados para llevarlos a cabo. Se pudo observar que, con la incorporación de estas etapas, se identificó un mayor número de aislamientos clínicos que con el método oficial recomendado por el fabricante. Relacionado con este aspecto, y gracias a la creación de un grupo de estudio europeo, se evaluó un nuevo procedimiento de extracción proteica basado en la sonicación, que apunta a ser el primer método de elección para la identificación de micobacterias mediante el MALDI-TOF MS. Los últimos tres estudios presentados, se focalizaron en aspectos más específicos de la identificación micobacteriana por el MALDI-TOF MS. En el primero de ellos, se introdujo la posibilidad de la diferenciación entre algunos grupos de especies dentro del complejo M. tuberculosis. Mediante el análisis manual de los espectros proteicos y la creación de un dendrograma se pudo separar, por un lado, los aislamientos de M. tuberculosis y, por otro, los aislamientos del conjunto formado por M. bovis y M. bovis-BCG. El siguiente estudio se centró, exclusivamente, en el medio de cultivo líquido, ya que suele mostrar una menor tasa de identificación. Debido a que la disponibilidad de la biomasa en el cultivo es un factor limitante para la identificación por el MALDI-TOF MS, se realizó el análisis en distintos períodos de tiempo (24 horas, 3, 5 y 7 días) tras ser detectados como positivos por los sistemas de incubación y detección automáticos. Se observó que a partir del tercer día de postincubación se lograba identificar de forma correcta gran parte de los aislamientos estudiados, por lo que una incubación prolongada de los medios líquidos podría ser recomendable para aumentar el número de cepas identificadas. Finalmente, en el último estudio se evaluaron los puntos de corte del score proporcionado por el MALDI Biotyper según la especie micobacteriana identificada. Con ello, se pudo determinar que un score ≥1,7 es adecuado para identificar de forma precisa la mayor parte de las especies más relevantes y frecuentemente aisladas. No obstante, en el caso de aquellas especies estrechamente relacionadas filogenéticamente, sería recomendable utilizar un score ≥2. En conclusión, mediante la incorporación de diversas mejoras en los diferentes aspectos críticos de la espectrometría de masas, será posible la implementación de la técnica del MALDI-TOF MS para la adecuada identificación micobacteriana laboratorios de microbiología clínica.
