Regulación de la secuencia de inserción ISPpu9 de Pseudomonas putida KT2440

• Autores: Guillermo Gómez García
• Directores de la Tesis: Fernando Rojo de Castro (dir. tes.), Renata Moreno Albiger (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2021
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Manuel Espinosa Urgel (presid.), Mario Mencía Caballero (secret.), Inés Canosa Pérez-Fragero (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Microbiología por la Universidad Autónoma de Madrid
• Materias:
  • Matemáticas
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen

  • Las secuencias de inserción (ISs) son elementos génicos móviles que incluyen solamente la información necesaria para realizar su propia transposición. El genoma de la bacteria modelo Pseudomonas putida KT2440 posee siete copias de una IS llamada ISPpu9 insertadas unas secuencias palindrómicas repetidas e invertidas llamadas REP.

    En este trabajo se muestra que la expresión del gen que codifica para la transposasa de ISPpu9, tnp, está regulado por dos RNAs pequeños llamados Asr9 y Ssr9, cuyos genes están localizados justo antes y después del gen tnp, respectivamente. El mRNA de tnp tiene una larga región 5’ no traducida (5’ UTR) que puede plegarse en una estructura secundaria que incluye la zona de unión del ribosoma, lo que impediría la correcta unión de la maquinaria de traducción. Mutaciones en esta región diseñadas para debilitar esta estructura aumentaron la traducción del mRNA de tnp. Asr9 es un RNA anti-sentido complementario a la región 5’ UTR del mRNA de tnp. La ausencia de Asr9 redujo significativamente la traducción de este mRNA, lo que sugiere que Asr9 ayuda a deshacer la estructura secundaria de la región 5’ UTR, dejando la RBS accesible al ribosoma. La sobre-producción ectópica de Asr9 aumentó la frecuencia de transposición de una nueva copia de ISPpu9 que entraba en la célula por conjugación, resultado que también apoya que este sRNA activa la expresión de la transposasa. El otro sRNA, Ssr9, tiene una complementariedad significativa con Asr9, hibridando con él in vitro y formando un dúplex de RNA. Observamos que Asr9 es muy estable, mientras que Ssr9 no lo es. Proponemos que Ssr9 puede secuestrar Asr9, posiblemente, facilitando su degradación. Por lo tanto, Asr9 activaría la expresión de tnp, aumentando la frecuencia de transposición, mientras que Ssr9 contrarrestaría a Asr9, disminuyendo la expresión de tnp.

    La inactivación del gen que codifica para la proteína Hfq, una chaperona de RNA muy importante en regulación post-transcripcional, aumentó significativamente la frecuencia de transposición de ISPpu9. Se comprobó que, in vitro, Hfq se une a Asr9 y Ssr9, pero no parece influir en la formación un híbrido entre los dos sRNAs. La ausencia de Hfq no parece afectar a la expresión del gen tnp de ISPpu9. Por lo tanto, Hfq inhibiría la frecuencia de transposición de ISPpu9 por un mecanismo que aún no está claro.

    Finalmente, en los extremos de ISPpu9 hemos identificado unas secuencias conservadas en todas las copias de esta IS que hemos denominado cajas “A” y “B”. La eliminación de estos elementos alteró significativamente el proceso de transposición de ISPpu9, indicando que las cajas “A” y “B” son necesarias para la correcta inserción de ISPpu9.