Novel dendritic multifunctional nanocarriers and their application in biomedicine
- Autores: María San Anselmo Jarauta
- Directores de la Tesis: José Luis Serrano (dir. tes.), Silvia María Hernández Ainsa (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Zaragoza ( España ) en 2021
- Idioma: español
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Química Orgánica por la Universidad de Zaragoza
- Materias:
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- Resumen
En el marco de las posibilidades ofrecidas por la nanotecnología, los materiales dendríticos presentan un gran interés debido a su gran potencial como transportadores de moléculas de diversa naturaleza. En este sentido, los dendrímeros y materiales derivados han sido ampliamente utilizados en biomedicina como transportadores de fármacos y de material genético. Dentro de la gran variedad de dendrímeros existente, la presente tesis doctoral se ha centrado en el estudio de materiales dendríticos basados en el ácido 2,2´-bis(hidroximetil)propiónico (bis-MPA) y el ácido 2,2’-bis(gliciloximetil)propiónico (bis-GMPA). Éste último incluye grupos amida internos potencialmente capaces de establecer puentes de hidrógeno con las moléculas que aloje en su interior y reforzar de esta manera su interacción para una encapsulación más eficiente.
Basados en estas unidades mínimas, se han diseñado dos tipos de materiales dendríticos: dendrímeros de tipo Jano anfífilos y polímeros hiperramificados dendronizados (DHPs, por sus siglas en inglés).
Los dendrímeros tipo Jano anfífilos combinan una cara hidrófila con una lipófila y en esta tesis doctoral, se ha alternado la composición bis-MPA/ bis-GMPA entre ambas caras. Además, también se ha modificado el número de cadenas lipófilas (2 ó 4), alterando de esta manera el balance hidrófilo del dendrímero resultante. En concreto, los dendrímeros Jano sintetizados han sido: - (NH3+)8[GMPA]-[MPA](C17)2 que consiste en un dendrón hidrófilo de bis-GMPA 3ª generación y un dendrón lipófilo de bis-MPA de 1ª generación, - (NH3+)8[GMPA]-[MPA](C17)4 que consiste en un dendrón hidrófilo de bis-GMPA 3ª generación y un dendrón lipófilo de bis-MPA de 2ª generación, - (NH3+)8[MPA]-[GMPA](C17)2 que consiste en un dendrón hidrófilo de bis-MPA 3ª generación y un dendrón lipófilo de bis-GMPA de 1ª generación, - (NH3+)8[MPA]-[GMPA](C17)4 que consiste en un dendrón hidrófilo de bis-MPA 3ª generación y un dendrón lipófilo de bis-GMPA de 2ª generación.
Por otra parte, los DHPs sintetizados consisten en un núcleo hiperramificado de bis-MPA de diferentes generaciones (G2, G3 o G4) en el cual se han insertado dendrones de bis-MPA o de bis-GMPA, obteniendo en ambos casos macromoléculas globulares policatiónicas. Esta última característica es de gran interés para acomplejar electrostáticamente diversas moléculas de naturaleza aniónica. Específicamente, se han sintetizado seis DHPs que se pueden clasificar de la siguiente manera según los dendrones componentes: Serie bis-MPA: - DHP(G2)-MPA que consiste en un núcleo hiperramificado de 2ª generación rodeado de dendrones de bis-MPA, con un total de 64 grupos amino terminales teóricos, - DHP(G3)-MPA que consiste en un núcleo hiperramificado de 3ª generación rodeado de dendrones de bis-MPA, con un total de 128 grupos amino terminales teóricos, - DHP(G4)-MPA que consiste en un núcleo hiperramificado de 4ª generación rodeado de dendrones de bis-MPA, con un total de 256 grupos amino terminales teóricos.
Serie bis-GMPA: - DHP(G2)-GMPA que consiste en un núcleo hiperramificado de 2ª generación rodeado de dendrones de bis-GMPA, con un total de 64 grupos amino terminales teóricos, - DHP(G3)-GMPA que consiste en un núcleo hiperramificado de 3ª generación rodeado de dendrones de bis-GMPA, con un total de 128 grupos amino terminales teóricos, - DHP(G4)-GMPA que consiste en un núcleo hiperramificado de 4ª generación rodeado de dendrones de bis-GMPA, con un total de 256 grupos amino terminales teóricos.
En todos los casos, la estrategia empleada para la unión de los dendrones entre sí o la unión de los dendrones al núcleo hiperramificado ha sido la reacción de cicloadición 1,3-dipolar entre grupos azida y alquino catalizada por Cu (I), CuAAC, dando lugar a un anillo de triazol.
Tras sintetizar, caracterizar y estudiar las propiedades de ambos tipos de materiales dendríticos en medio acuoso (capítulo 2), se ha realizado un estudio más específico de los dendrímeros tipo Jano como transportadores de fármacos anti-hepatitis C (capítulo 3) y anti-tuberculosos (capítulo 4); mientras que los DHPs se han explorado como vectores de heparina en el tratamiento de la malaria (capítulo 5) y como vectores de material genético dentro de la estrategia denominada transfección génica (capítulo 6).
El estudio de la hepatitis C se ha focalizado en rescatar la actividad antiviral de dos compuestos que inhiben la actividad de la proteasa viral NS3 in vitro, pero que presentan escasa actividad en estudios celulares. Estos compuestos son el ácido iopanoico (IA) y el tiratricol (TRIAC), y ambos se han solubilizado con la ayuda de dendrímeros Jano como nanotransportadores. Inicialmente, se ha realizado un estudio calorimétrico para evaluar la interacción entre los compuestos y los agregados dendríticos, y posteriormente, se han incorporado dichos compuestos mediante difusión en los agregados dendríticos previamente formados. Estos agregados cargados con los compuestos se han caracterizado morfológicamente y se ha evaluado su actividad antiviral al mismo tiempo que se ha estudiado su efecto citotóxico sobre las células. Los dendrímeros más prometedores para esta aplicación han sido (NH3+)8[GMPA]-[MPA](C17)2 y (NH3+)8[GMPA]-[MPA](C17)4, consiguiendo reducir considerablemente la EC40 de los fármacos libres.
En cuanto a la tuberculosis, el carácter anfífilo de los dendrímeros Jano se ha aprovechado para encapsular fármacos de diferente naturaleza de manera individual (rifampicina (RIF), isoniazida (INH), estreptomicina o bedaquilina) y combinaciones de ellos (RIF+INH). Los agregados resultantes se han caracterizado y la cantidad de fármaco encapsulada se ha cuantificado mediante HPLC. Adicionalmente, se ha evaluado la actividad antimicrobiana de todos los fármacos libres y encapsulados individualmente en los cuatro dendrímeros Jano frente a M. bovis BCG, comprobando que se mantiene de manera generalizada la actividad de los fármacos tras su encapsulación excepto en el caso de la bedaquilina. Posteriormente y tras comprobar la ausencia de sinergismo entre RIF e INH libres, se ha seleccionado el dendrímero (NH3+)8[GMPA]-[MPA](C17)4 para realizar la co-encapsulación de ambos (RIF+INH), y tras la correspondiente caracterización de los nanoagregados resultantes, se ha explorado su actividad antimicrobiana frente a diferentes cepas (M. bovis BCG, M. tuberculosis y Mtb-THP1). Otro estudio interesante realizado ha consistido en la evaluación de la cinética de muerte de Mtb con el tiempo frente a las diferentes combinaciones de fármacos libres y encapsulados en el dendrímero, lo que permite visualizar la aparición de resistencias bacterianas. En este sentido, ciertas condiciones de fármacos encapsulados han permitido retrasar la aparición de resistencias bacterianas, lo cual es muy positivo e interesante de cara a posibles estudios in vivo.
El estudio sobre la malaria se ha centrado en mejorar las propiedades ventajosas del polisacárido heparina como agente antimalárico y como molécula de direccionamiento hacia glóbulos rojos infectados por el parásito. Para ello, se han empleado los DHPs como vectores capaces de acomplejar la heparina y potencialmente capaces de reducir los efectos laterales perjudiciales del tratamiento con el polisacárido (fuerte actividad anticoagulante que puede derivar en hemorragias cerebrales, escaso tiempo de circulación en sangre, etc.). En primer lugar, se han formado los complejos DHP/heparina mediante interacciones electrostáticas y se han caracterizado morfológicamente. A continuación, se ha estudiado la cinética de liberación de la heparina de los complejos, observando un posible efecto de las amidas del bis-GMPA como grupos capaces de establecer puentes de hidrógeno y retener en mayor medida el polisacárido. La actividad antiparasitaria de todos los complejos DHP/heparina formados, así como la de los complejos entre la heparina y los DHPs marcados con el fluoróforo rodamina (DHP-Rh/heparina), ha revelado buenos niveles de actividad de la heparina acomplejada, mejorando la IC50 de la heparina libre en algunos casos. Además, se ha estudiado mediante distintas técnicas el direccionamiento preferencial de los complejos DHPs-Rh/heparina frente a glóbulos rojos sanos o infectados por el parásito. Por último, se ha estudiado el tiempo de circulación en plasma de la heparina libre y formando complejos con los DHPs en un modelo animal in vivo.
Los DHPs también se han explorado como vectores no virales para introducir material genético en células tumorales (HeLa) y mesenquimales (mMSCs); es decir, para la aplicación denominada transfección génica. En primer lugar, se han establecido los ratios N/P a los cuales se forman los dendriplejos (complejos entre dendrímero y material genético) con pDNA y siRNA. Tras caracterizar los dendriplejos mediante diversas técnicas fisico-químicas, se ha evaluado su actividad como vectores génicos en las correspondientes líneas celulares, empleando la proteína verde fluorescente (GFP) como marcador. La valoración de los resultados de transfección (sobreexpresión de GFP con pDNA o inhibición de GFP con siRNA) junto a la toxicidad producida en las líneas celulares, postulan a los DHPs de la serie de bis-MPA como mejores candidatos, ya que los homólogos de la serie bis-GMPA presentan una actividad prácticamente despreciable, probablemente debido a su menor internalización celular y a una menor disociación del material genético del dendriplejo. En concreto, la actividad como vector de transfección mejora conforme aumenta la generación del núcleo hiperramificado y son necesarios ratios N/P elevados para alcanzar buenos niveles de transfección e incluso superar a agentes comerciales muy eficaces.
