Resumen de Estudio de las resistencias a los fármacos y los mecanismos moleculares más frecuentes en mycobacterium tuberculosis complex en españa
La tuberculosis es la enfermedad infecciosa con mayor mortalidad provocada por un solo microorganismo (con excepción del virus SARS-CoV-2), y una de las diez principales causas de muerte en el mundo. De hecho, en el último informe de la Organización Mundial de la Salud (OMS), se estima que al año 10 millones de personas enferman de tuberculosis y que ocasiona 1,4 millones de fallecimientos. La aparición de aislamientos clínicos multirresistentes (MDR) y su diseminación sigue siendo uno de los mayores problemas de salud mundial, conllevando una mayor gravedad de la enfermedad, una menor tasa de curación y una prolongación del tratamiento, así como un incremento del riesgo de toxicidad y un mayor gasto sanitario. Por ello, el diagnóstico rápido de la enfermedad y de la farmacorresistencia son dos de los pilares fundamentales para el control de la tuberculosis. De este modo, se puede iniciar cuanto antes el tratamiento farmacológico y el estudio de contactos, rompiendo así la cadena de transmisión y reduciendo su impacto epidemiológico, y muy especialmente en determinados colectivos (p. ej. Inmunodeprimidos).
Tradicionalmente, el diagnóstico de la tuberculosis se ha realizado mediante métodos microbiológicos convencionales como la baciloscopia y el cultivo micobacteriano. Sin embargo, estos presentan una serie de inconvenientes. Por un lado, la observación al microscopio de la baciloscopia tiene una baja sensibilidad (45-80% de los aislamientos de tuberculosis con cultivo positivo) y, por otro lado, el cultivo de Mycobacterium tuberculosis complex (especialmente en medio sólido) es muy lento y puede tardar hasta seis semanas en crecer.
En los últimos años se han desarrollado diversos métodos, fundamentalmente moleculares, de gran utilidad y que han supuesto un importante avance en el diagnóstico rápido de la tuberculosis, así como la detección rápida de la farmacorresistencia, con una notable sensibilidad y especificidad. La OMS, respalda y recomienda el uso de algunos de estos sistemas desde hace años, en virtud de su relación coste-beneficio y sus buenos resultados. Entre ellos, destacan los basados en la amplificación de ácidos nucleicos (PCR) del genoma micobacteriano para posteriormente hibridarlos con sondas marcadas e inmovilizadas en una membrana de nitrocelulosa, como el GenoType (Hain Lifescience, Nehren, Germany), entre otros, o bien mediante PCR a tiempo real, en las cuales se amplifica e hibrida simultáneamente el producto de la amplificación del ADN con sondas marcadas con fluorescencia. Dentro de estas últimas, el sistema más conocido y promocionado es el sistema GeneXpert (Cepheid, Sunnyvale, USA).
En España, existe una monitorización insuficiente de la tuberculosis, no incluyendo en la declaración obligatoria la notificación de algunos datos relevantes del paciente y de laboratorio. Esta infra-notificación afecta, de forma relevante, a gran parte de los datos de sensibilidad a los fármacos contra la tuberculosis. De este modo, muchos de los datos existentes proceden de estudios puntuales más o menos representativos a nivel geográfico y/o temporal. Por ello los objetivos de esta tesis son: 1) conocer en la actualidad la resistencia a los fármacos antituberculosos en múltiples áreas geográficas de España, además de analizar los mecanismos moleculares relacionados con la misma y determinar qué factores clínico-epidemiológicos pueden estar asociados a la resistencia (Estudio REMOTUBES; 2016-2018); 2) conocer y analizar cómo ha evolucionado la resistencia a los fármacos antituberculosos en España en la última década (2006-2016), y determinar qué factores clínico-epidemiológicos pueden estar implicados en la resistencia a la tuberculosis en el país; 3) evaluar la eficacia de un sistema de PCR a tiempo real ultrasensible para la detección de M. tuberculosis complex y su multirresistencia; y 4) evaluar el rendimiento diagnóstico del sistema molecular Anyplex II MTB/MDR/XDR para la detección rápida de las resistencias a los fármacos antituberculosos más importantes en M. tuberculosis complex.
Los resultados del estudio REMOTUBES mostraron, en líneas generales, unos porcentajes de resistencia bajos a los fármacos contra la tuberculosis en nuestro país, a pesar de un ligero incremento global (13,1%) en comparación con estudios previos (9,2%). La Isoniacida fue el fármaco con un mayor número de casos resistentes, seguido por la Estreptomicina y la Pirazinamida. Por otro lado, la Isoniacida presentó un porcentaje de casos con resistencia inicial (6,4%) bastante parecido a los datos publicados en trabajos anteriores (5,7%), y algo inferior en pacientes con antecedentes de tratamiento antituberculoso previo (18%), tanto en nacidos en España (10,8%) como en extranjeros (29,2%). En cuanto a la multirresistencia (MDR-TB), el porcentaje de casos con resistencia inicial (1,5%) y adquirida (13,1%) fue bastante similar al de estudios previos en España (1,2 y 12,9%, respectivamente). El análisis de los mecanismos de resistencia mostró que, de los pacientes con tuberculosis resistente a la Isoniacida, el 55,2% de ellos presentaban mutaciones en el gen katG, relacionado con elevados niveles de resistencia. Por otro lado, un tercio (31,3%) de los pacientes que fueron resistentes a este fármaco presentaron mutaciones en el gen inhA, asociado con resistencia fenotípica de bajo nivel. En relación a los mecanismos de resistencia observados, estos pueden ser detectados, en una gran proporción y de forma rápida y sencilla, mediante los métodos de diagnóstico molecular disponibles en la actualidad. De esta forma, se podría llevar a cabo un diagnóstico rápido de la resistencia en tuberculosis en nuestro país, en una gran parte de los pacientes que lo requiriesen de forma específica. Así, la relación del gen katG con la multirresistencia, ya bien descrita, se observó claramente en este estudio, ya que el gen katG estaba mutado en el 71,4% de los casos MDR-TB, que está en consonancia con los trabajos anteriores en nuestro país. De modo similar sucedió con la proporción de casos multirresistentes con el gen inhA alterado, la cual se mantiene en niveles similares (inferiores al 20%). Por otro lado, si bien el porcentaje de casos resistentes a la Rifampicina ha sido algo más elevado (2,7%) que en estudios previos en España (1,9%), la proporción de casos resistentes a este fármaco que fue a su vez MDR-TB (84%), fue menor que en esos estudios en nuestro país (90-100%). Aun así, la Rifampicina continúa siendo un buen marcador de multirresistencia, y por ello es interesante remarcar que el 100% de las mutaciones relacionadas con la resistencia a este antimicrobiano se encontraron en el gen rpoB, localizándose el 76% de ellas en el codón 531, que está relacionado con altos niveles de resistencia a la Rifampicina. En lo que respecta a las fluoroquinolonas, el 66,7% de los casos resistentes presentaron mutaciones en el gen gyrA. En el estudio también se reveló la posible presencia de resistencias cruzadas entre los fármacos útiles en el tratamiento de la tuberculosis, a parte de las fluoroquinolonas, como por ejemplo la existente entre la Isoniacida (con el gen inhA mutado) y la Etionamida (56,3%), la que hay entre la Rifampicina y Rifabutina (76%), entre la Amikacina y la Estreptomicina (100%) o en menor medida entre la Capreomicina y la Amikacina/Kanamicina (33,4%). El análisis de las características socio-demográficas y clínicas mostró que los principales factores de riesgo asociados a la tuberculosis multirresistente fueron principalmente el hecho de haber recibido tratamiento previo con fármacos antituberculosos (representando un riesgo diez veces mayor de tener MDR-TB respecto a los casos nuevos de tuberculosis), ser extranjero (riesgo seis veces mayor) y tener coinfección por el VIH (riesgo cuatro veces mayor). Respecto al tratamiento farmacológico de la tuberculosis, este fue satisfactorio en casi el 90% de los casos, lo que denota el adecuado tratamiento prescrito (fundamentalmente de cuatro fármacos iniciales) y la adherencia al mismo de los pacientes con tuberculosis en el periodo del estudio REMOTUBES. Con todo, a pesar de que los datos de resistencia a los antimicrobianos de M. tuberculosis complex en España no son muy elevados, diversos aspectos sociales del contexto actual, como los flujos migratorios y la infra-notificación existente de los datos de resistencia, entre otros, hacen que sea muy necesario, siguiendo las recomendaciones de la OMS, seguir realizando estudios de sensibilidad a los fármacos en tuberculosis que sean representativos en nuestro país.
En el segundo estudio, los resultados también mostraron bajos porcentajes de resistencia a algún fármaco contra la tuberculosis en España entre 2006 y 2016 (9,7%), así como bajos niveles de MDR-TB (1,6%). Se observó una tendencia creciente de casos resistentes a lo largo del periodo de estudio (8,9% en 2006 y 12,0% en 2016), similar a la de otros países europeos como Alemania, entre otros. Sin embargo, hubo años en los que la tasa de resistencia a algún fármaco antituberculoso varió considerablemente, como sucedió en 2013 (5,1%), 2014 (23,7%) y 2015 (15,1%), mientras que en otros años fueron más similares al promedio. En cuanto a los fármacos, destacaron los resultados de monorresistencia asociados a la Isoniacida y la Estreptomicina, además de los niveles de resistencia conjunta entre ambos antimicrobianos. En general, la multirresistencia se encontró en el 1,6% de los casos estudiados, pero mostró una tendencia significativamente mayor durante el periodo de estudio (p <0,01): la MDR-TB representó 8/787 (1,0%) casos de tuberculosis en 2006 y 9/416 (2,2%) en 2016, con un notable incremento de casos en 2015 (9/239 casos MDR-TB que representaron el 3,8%). Estos niveles de multirresistencia se pueden considerar bajos si se comparan con los datos proporcionados por la OMS a nivel mundial (4,1%) y el EDCD en Europa (3,8%). En referencia a los factores de riesgo asociados con la resistencia, el hecho de ser extranjero fue de gran relevancia, especialmente en los pacientes provenientes de Pakistán, un país con elevada prevalencia de tuberculosis y de MDR-TB. Otros factores de riesgo que incrementaron la probabilidad de tener MDR-TB, además del origen del paciente, fueron tener más de 50 años, el hecho de haber recibido tratamiento previamente con fármacos antituberculosos, el tipo de convivencia o la coinfección con el VIH. Así, los datos obtenidos en este estudio sugieren que la multirresistencia, un fenómeno que surgió en la década de 1950 en respuesta a los primeros antibióticos empleados contra la tuberculosis, continúa representando un desafío en el siglo XXI. Es esencial realizar, entre otros aspectos, un diagnóstico microbiológico de la resistencia de manera más rápida y precisa, acortando así los tiempos de detección, para combatir la tuberculosis multirresistente.
En el tercer estudio se evaluó el sistema de PCR a tiempo real Xpert MTB/RIF Ultra para la detección de M. tuberculosis complex y la resistencia a la Rifampicina. Este sistema integrado ya se había analizado anteriormente para el diagnóstico rápido de la tuberculosis pulmonar en adultos, niños y pacientes con VIH, pero no así para la tuberculosis extrapulmonar donde las muestras tienen una baja carga bacilar, lo cual supone todo un desafío a la hora de detectar material genético micobacteriano en ellas. Para este grupo de muestras, todas ellas negativas en la baciloscopia, la técnica resultó ser de gran utilidad al mostrar una sensibilidad de detección del ADN del microorganismo (y por lo tanto de la enfermedad) del 75,9%, y una especificidad del 100%. Para ello se estudiaron muestras con cultivo positivo para el complejo M. tuberculosis, muestras que contenían micobacterias no tuberculosas y muestras con cultivo micobacteriano negativo. Los resultados obtenidos fueron superiores a los de estudios previos donde se emplearon muestras similares y una versión anterior de este sistema de PCR a tiempo real. Además, los resultados fueron proporcionados de manera más rápida, y destacando la rentabilidad obtenida en los líquidos pleurales, una de las muestras menos óptimas para detectar ADN micobacteriano, y sus excelentes datos con muestras de origen ganglionar y fluidos no estériles. Si bien es cierto que esta técnica molecular es capaz de detectar resistencia a la Rifampicina (marcador de multirresistencia), en el estudio se incluyó un número bajo de muestras con mutaciones relacionadas con la resistencia a la Rifampicina. Por ello, no se pudo valorar su utilidad en la detección precoz de resistencias a este medicamento. La principal limitación de este sistema molecular ultra sensible parece basarse en el mismo incremento de la sensibilidad, que conlleva una cierta disminución de la especificidad, tal y como afirman varios trabajos, por la presencia de ADN de M. tuberculosis complex o bacilos intactos. No obstante, ello no fue observado en el presente estudio. Por otro lado, la aparición de una nueva categoría semicuantitativa de resultado (“Trace”) también podría ser una limitación de la técnica, al no proporcionar información sobre la resistencia a la Rifampicina en estos casos. Sin embargo, esta situación tiene poca relevancia en áreas con baja incidencia de MDR-TB, tal y como sucede en España. En virtud de los resultados y de la rapidez de la técnica (33 minutos menos para un resultado negativo y 45 minutos menos para un resultado positivo, en comparación a su predecesora), el Servicio de Microbiología del Hospital de Bellvitge implementó el Xpert MTB/RIF Ultra como técnica de rutina en todo tipo de muestras clínicas con baciloscopia negativa o positiva para el diagnóstico de una tuberculosis pulmonar y/o extrapulmonar ante una sospecha clínica media o alta de padecer la enfermedad.
En cuanto al cuarto estudio, donde se compararon dos técnicas moleculares (Anyplex II MTB/MDR/XDR y GenoType MTBDRplus/MTBDRsl) para detectar M. tuberculosis complex multirresistente y con resistencia extendida, ambas técnicas demostraron una notable sensibilidad en la detección de mutaciones relacionadas con la resistencia a la Isoniacida, Rifampicina y fluoroquinolonas, si bien es cierto que el GenoType presentó en algunos casos una sensibilidad ligeramente superior. Respecto a la Isoniacida, ambas técnicas lograron identificar la misma cantidad de mutaciones en el gen katG, y el GenoType identificó dos mutaciones más en inhA que el Anyplex. De modo similar sucedió con la Rifampicina, con datos notables en cuanto a la capacidad de detección de resistencias a este fármaco mediante el Anyplex (84,6%) pero inferior a la mostrada por el GenoType (100%). Esa diferencia se basó en dos aislamientos resistentes que no identificó el Anyplex y que tenían mutaciones en posiciones del gen rpoB que también contempla la prueba Anyplex II MTB/MDR/XDR. Esos dos aislamientos, a su vez, fueron MDR-TB. Con relación a los datos de MDR-TB, la capacidad de detección entre ambas técnicas fue similar a la obtenida en la Rifampicina (81,8% en Anyplex y 100% en GenoType). En las fluoroquinolonas, de los 57 aislamientos analizados en el estudio, tan solo cuatro presentaron resistencia según el método fenotípico, detectando el Anyplex y el GenoType mutaciones en todas ellas (100%). Sin embargo, ya que el número de cepas resistentes a las fluoroquinolonas analizadas en este trabajo es bajo, serían necesario una mayor cantidad de aislamientos para obtener una conclusión más sólida sobre la sensibilidad de estos sistemas moleculares para este grupo de fármacos. En lo que respecta a los aminoglucósidos y péptidos cíclicos (inyectables de segunda línea), la prueba de sensibilidad fenotípica detectó resistencia en tan solo dos aislamientos (uno a la Amikacina y uno a la Kanamicina), y la sensibilidad de ambas técnicas moleculares fue baja (50%, detectando tan solo la resistencia asociada a la Kanamicina). Tal y como sucede con las fluoroquinolonas, se debe tener en cuenta el bajo número de cepas estudiadas resistentes a este grupo de fármacos. Los resultados para la Estreptomicina, Etambutol y Pirazinamida no fueron los deseados en ninguna de las dos técnicas moleculares, debido a que se contemplan pocas dianas (Estreptomicina) o ninguna (Etambutol en el caso del GenoType MTBDRsl v 2.0, y la Pirazinamida en ambos métodos). En cuanto a las características propias de cada método molecular, el Anyplex proporcionó los resultados más rápidamente que el GenoType, reduciendo el tiempo global en 4-5 horas, conllevando una menor manipulación y una menor contaminación cruzada. En suma, tanto el Anyplex como el GenoType demostraron tener una buena capacidad de detección de mutaciones relacionadas con la resistencia a la Isoniacida, Rifampicina y fluoroquinolonas en el complejo M. tuberculosis. Si bien el GenoType detectó alguna resistencia más, el Anyplex fue una técnica diagnóstica más rápida.
En conclusión, la resistencia a los fármacos antituberculosos en España para M. tuberculosis complex en los últimos 13 años y en la actualidad es baja, si se comparan estos datos con los expuestos a nivel mundial por la OMS y a nivel europeo por el EDCD. Sin embargo, se observó una tendencia ligeramente creciente de casos resistentes a lo largo del periodo de estudio (2006-2016 y 2016-2018) similar a la de otros países europeos, probablemente relacionada con diversos factores, como la inmigración entre otros. Además, las técnicas moleculares basadas en la amplificación del ADN y posterior hibridación del producto de la PCR en fase sólida (PCR-hibridación reversa), y aquellas basadas en la amplificación e hibridación simultánea del ADN con sondas marcadas con fluorescencia (PCR a tiempo real) han demostrado ser unas herramientas útiles para la identificación de micobacterias tuberculosas y para el diagnóstico rápido presuntivo de la MDR-TB y XDR-TB que, no obstante, requiere una confirmación mediante pruebas de sensibilidad fenotípicas.
