Resumen de Mutación y recombinación en cepas naturales de Escherichia coli y efecto de los antibióticos sobre la recombinación
1. INTRODUCCIÓN.......................................................................... 4 1.1. MUTACIÓN Y RECOMBINACIÓN COMO MOTORES DE LA EVOLUCIÓN.................................. 4 1.1.1. Incidencia de mutadores en el laboratorio y en la naturaleza......................................................... 5 1.1.2. Estrés antibiótico como modelo de estudio de la evolución adaptativa........................................... 7 1.2. HIPERMUTADORES E HIPERRECOMBINADORES............................................... 8 1.2.1. Hipermutación estable ............................................................................... 8 1.2.1.1. MMR o sistema de reparación de emparejamientos erróneos .................................................................. 10 1.2.1.2. Sistema GO........................................................................................... 12 1.2.1.3. Hipermutación estable como estrategia adaptativa .................................................................................. 13 1.2.2 Hipermutación transitoria. El Sistema SOS.................................................................................... 14 1.2.2.1. El sistema SOS...................................................................................... 14 1.2.2.2. Mutagénesis SOS......................................................................................... 16 1.2.2.3. Antibióticos inductores del Sistema SOS................................................................................................. 17 1.3. MMR, SOS Y RECOMBINACIÓN..................................................................... 19 1.3.1. Control de la barrera genética entre especies bacterianas: MMR y sistema SOS......................... 20 2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS............................................................................ 23 3. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................. 24 3.1. MEDIOS, REACTIVOS Y CONDICIONES DE CULTIVO................................................................ 24 3.2. CEPAS. ..................................................................................... 24 3.2.1. Cepas de laboratorio y plásmidos.............................................................................. 24 3.2.2. Colecciones de cepas naturales. ............................................................................. 26 3.2.2.1. Colección de cepas Comensales.......................................................................... 27 3.2.2.2. Colección de cepas Patógenas............................................................................... 27 3.3. TÉCNICAS GENERALES DE GENÉTICA BACTERIANA. .............................................................. 27 3.4. TÉCNICAS DE DNA..................................................................................... 28 3.4.1. Técnicas generales. ................................................................................ 28 3.4.2. Secuenciación de DNA. ................................................................................... 28 3.4.3. Oligonucleótidos utilizados en este trabajo. .................................................................................. 28 3.4.4. Amplificación aleatoria de DNA polimórfico (RAPD)................................................................... 29 3.4.5. Análisis filogenético ............................................................................... 30 3.5. ESTUDIO DE LA RECOMBINACIÓN..................................................................... 30 3.5.1. Construcción de las cepas lacZ diploides. ..................................................................................... 30 3.5.2. Estudio del efecto de los antibióticos en la recombinación intracromosómica. ............................ 31 3.5.3. Estudio del efecto de los antibióticos en la recombinación intercromosómica.............................. 32 3.5.3.1. Experimentos de Conjugación en E.coli. ................................................................................. 32 3.5.3.2. Experimentos de Conjugación en P.aeruginosa. .......................................................................... 33 3.5.4. Frecuencias de recombinación inter e intraespecíficas de las cepas comensales y patógenas de E.coli. ............................................................................... 33 3.6. DETERMINACIÓN DE LAS FRECUENCIAS DE MUTACIÓN........................................................ 34 3.7. ESTUDIO DE LA TRANSCRIPCIÓN DE GENES DEL SISTEMA SOS. ........................................... 35 3.7.1. Estudio de la transcripción de recA y dinB en las cepas de la colección de comensales de E.coli.................................... 35 3.8. TINCIÓN VITAL (LIVE/ DEAD) Y DAPI. .......................................................................................... 36 3.9. CÁLCULO DE LA CMI. ................................................................................ 36 3.10. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS.................................................................... 37 4. RESULTADOS.......................................................................... 38 CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE LA RECOMBINACIÓN EN CEPAS NATURALES DE E.COLI........ 38 4.1. TIPACIÓN MOLECULAR POR RAPD DE LAS CEPAS COMENSALES DE E.COLI. ...................... 38 4.2. ESTUDIO DE LA FRECUENCIA DE MUTACIÓN EN CEPAS COMENSALES DE E.COLI. ........... 38 4.3. ESTUDIO DE LA FRECUENCIA DE RECOMBINACIÓN EN CEPAS COMENSALES DE E.COLI. 39 4.3.1. Frecuencias de recombinación de las cepas comensales de E.coli................................................ 41 4.3.2. Análisis de las regiones diana.............................................................................. 44 4.4. ESTUDIO DE LOS NIVELES DE EXPRESIÓN DE GENES DEL SISTEMA SOS EN CEPAS COMENSALES DE E.COLI. ............................................................................. 46 4.5. RELACCIÓN ENTRE MUTACIÓN, RECOMBINACIÓN Y TRANSCRIPCIÓN DE RECA Y DINB EN CEPAS COMENSALES DE E.COLI. .......................................................................... 49 4.6. ESTUDIO DE MUTACIÓN Y RECOMBINACIÓN EN CEPAS PATÓGENAS DE E.COLI. .............. 49 4.6.1. Frecuencias de mutación de las cepas patógenas de E.coli........................................................... 50 4.6.2. Frecuencias de recombinación de las cepas patógenas de E.coli.................................................. 51 4.7. DISTRIBUCIÓN DE LAS FRECUENCIAS DE RECOMBINACIÓN EN CEPAS NATURALES DE E.COLI....................................................................... 52 4.8. DISTRIBUCIÓN DE LAS FRECUENCIAS DE MUTACIÓN EN CEPAS NATURALES DE E.COLI.53 CAPÍTULO 2: ANTIBIÓTICOS Y RECOMBINACIÓN........................................................................ 55 4.1. INDUCCIÓN DE LA RESPUESTA SOS POR CIP Y CAZ................................................................................. 56 4.2. ANTIBIÓTICOS Y RECOMBINACIÓN EN E.COLI.......................................................................................... 57 4.2.1. Efecto de Cip y Caz sobre la recombinación intracromosómica de E.coli. ................................... 57 4.2.1.1. Dependencia de la inducción del SOS para la estimulación de la recombinación mediada por Cip y por Caz................................................................................... 60 4.2.1.2. Caracterización molecular de las vías implicadas en la estimulación de la recombinación mediada por Cip ...................................................................................... 60 4.2.1.3. Efecto del sistema MMR en la estimulación de la recombinación mediada por Cip................................ 61 4.2.1.4. Efecto del tratamiento con concentraciones subinhibidoras de antibiótico sobre la viabilidad de las bacterias................................................................................ 63 4.2.2. Efecto de otros antibióticos sobre la recombinación intracromosómica en E.coli........................ 64 4.2.3. Efecto de Cip sobre la recombinación intercromosómica de E.coli. ............................................. 68 4.3. ANTIBIÓTICOS Y RECOMBINACIÓN EN P.AERUGINOSA. ............................................................... 69 5. DISCUSIÓN........................................................................ 71 5.1. MUTACIÓN Y RECOMBINACIÓN EN LA NATURALEZA............................................................. 71 5.1.1. Mutación ...................................................................................... 71 5.1.2. Recombinación...................................................................... 74 5.2. ANTIBIÓTICOS Y RECOMBINACIÓN................................................................. 81 6. CONCLUSIONES ..................................................................... 88 7. BIBLIOGRAFÍA ................................................................... 90
