Síntesis y caracterización de biodisolventes supramoleculares y desarrollo de estrategias innovadoras para la extracción y determinación de contaminantes
- Autores: Encarnación Romera García
- Directores de la Tesis: Soledad Rubio Bravo (dir. tes.), Ana Maria Ballesteros Gómez (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Córdoba (ESP) ( España ) en 2022
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Feliciano Priego Capote (presid.), Noelia Luque Plata (secret.), Ana Rita Cruz Duarte (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Química Fina por la Universidad de Córdoba
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: Helvia
- Resumen
Dentro de la Química Sostenible, el diseño de nuevos disolventes se ha convertido en un área prioritaria [1]. Los disolventes son unos de los compuestos químicos más ubicuos en el ámbito doméstico e industrial debido a su infinidad de aplicaciones. Desafortunadamente, muchos de los disolventes usados tradicionalmente son tóxicos, inflamables, proceden de recursos no renovables y/o contribuyen al efecto invernadero. Esto ha propiciado que en las dos últimas décadas se hayan desarrollado numerosas alternativas más seguras y respetuosas con el medio ambiente. Entre ellas, los disolventes supramoleculares (SUPRASs) son una opción prometedora.
Los SUPRASs son líquidos micro- o nanoestructurados que se generan a partir de disoluciones acuosas u orgánicas de moléculas anfifílicas, mediante procesos espontáneos de autoensamblaje y coacervación [2]. Sus procedimientos de síntesis son eficientes tanto desde el punto de vista energético como atómico. Además, estos disolventes poseen una serie de características que les confieren una alta capacidad para la extracción de compuestos orgánicos, lo que reduce el volumen de disolvente necesario para llevar a cabo estas operaciones. No obstante, hay una serie de aspectos que comprometen su sostenibilidad. Para su producción se suelen usar tensioactivos sintéticos de origen petroquímico, disolventes orgánicos, altas temperaturas o condiciones extremas de acidez.
Uno de los objetivos principales de esta Tesis ha sido el diseño de biodisolventes supramoleculares (bioSUPRASs), que se adecúan en mayor medida a los principios de la Química Sostenible. La síntesis de estos nuevos coacervados se realiza a temperatura ambiente y se utilizan disoluciones acuosas de biotensioactivos y agentes coacervantes inocuos. Como biotensioactivos se han seleccionado unos glicolípidos denominados ramnolípidos, que son producidos por bacterias y presentan baja toxicidad y alta biodegradabilidad. Además, tienen excelentes propiedades fisicoquímicas y actividad superficial y biológica.
El segundo reto abordado, también en línea con la sostenibilidad, ha sido la monitorización efectiva y simple de contaminantes emergentes. Una gran cantidad de compuestos químicos son liberados al medio ambiente a través de emisiones y vertidos procedentes de la industria, la agricultura, la ganadería e incluso de la actividad cotidiana. Hay muchas de estas sustancias, que son nuevas o que hasta ahora han pasado inadvertidas, de las que no se tienen datos suficientes sobre sus efectos potenciales en la salud y su incidencia en la naturaleza. Para poder llevar a cabo estas investigaciones es necesario disponer de métodos fiables, simples y rápidos para su determinación. Por esta razón, el segundo objetivo de la presente Tesis ha sido el desarrollo de estrategias innovadoras para la determinación de dos familias de contaminantes emergentes: los bisfenoles y las cianotoxinas.
Los bisfenoles son alteradores endocrinos, que pueden causar efectos adversos sobre la salud, como enfermedades metabólicas (obesidad y diabetes), formación de tumores o alteraciones en el desarrollo del sistema neurológico de los fetos [3]. Estos compuestos se usan en la producción de policarbonatos y resinas epoxi, materiales que a su vez se utilizan para la fabricación de botellas y envases que están en contacto directo con alimentos. Por ello, una de las principales vías de exposición humana a los bisfenoles es la dieta. Por otro lado, las cianotoxinas son un grupo muy heterogéneo de compuestos, entre los cuales se incluyen hepatotoxinas, neurotoxinas, citotoxinas y dermatotoxinas [4]. La eutrofización, el incremento de la concentración de CO2 y el calentamiento global están provocando un aumento de la población de cianobacterias en las aguas y, por tanto, de la concentración de cianotoxinas. Se han reportado numerosos casos de intoxicaciones debidas a estas sustancias, sobre todo por realizar actividades de ocio en aguas contaminadas y por el consumo de agua que no ha sido tratada de forma adecuada. Debido a estos motivos, es fundamental desarrollar estrategias analíticas para poder controlar los niveles de ambos grupos de contaminantes.
2. Contenido La memoria de esta Tesis Doctoral se ha estructurado en varias secciones. En primer lugar, se exponen los objetivos que han motivado la realización de esta Tesis. En la Introducción, se discute la necesidad de desarrollar alternativas a los disolventes orgánicos tradicionales y se describen aspectos teóricos y prácticos relacionados con los SUPRASs. Posteriormente, se presentan los artículos derivados de las investigaciones realizadas (Capítulos I-IV), que se han agrupado en dos bloques (Bloque A y B). Por último, se han recapitulado las conclusiones más relevantes de los diferentes estudios.
A continuación, se resume el contenido de cada uno de los bloques.
Bloque A. Biodisolventes supramoleculares basados en ramnolípidos: síntesis, caracterización y potencial en procesos de extracción En este bloque, se han desarrollado dos procedimientos para la síntesis de bioSUPRASs a partir de disoluciones acuosas de ramnolípidos, y se han caracterizado las fases nanoestructuradas obtenidas. En primer lugar, se han construido los diagramas de fases de las mezclas ramnolípido/agua/agente coacervante, en los que ha quedado delimitada la región de formación de los biodisolventes. A continuación, se ha estudiado el volumen de disolvente que se genera en función de las condiciones de síntesis, y se ha determinado la composición de los diferentes coacervados obtenidos. También se ha realizado una caracterización morfológica y estructural de los bioSUPRASs, mediante técnicas tales como la dispersión dinámica de la luz y microscopía óptica y electrónica. Por último, se ha evaluado su capacidad de extracción, utilizando colorantes como compuestos modelo.
Los experimentos realizados en el Capítulo I han revelado que, en los sistemas coloidales constituidos por agregados de ramnolípidos, la coacervación se puede inducir mediante la adición de sales que provoquen la neutralización de la carga y la deshidratación de los grupos polares del tensioactivo [5]. Para ello, los mejores agentes coacervantes han resultado ser NaCl y Na2SO4. Los bioSUPRASs así obtenidos son sensibles al ambiente, su composición y estructura pueden modificarse cambiando las condiciones de síntesis. Cuanto mayor es la concentración de sal adicionada, se originan biodisolventes más deshidratados y compactos y, por tanto, el volumen que se genera es menor. La composición de los coacervados producidos oscila entre 19-40% ramnolípido, 50-77% agua y 5-12% sal (%, p/p). Las técnicas de caracterización estructural han desvelado que en estos disolventes coexisten micelas y vesículas cuyos tamaños van de los pocos nm hasta los µm. Además, se ha comprobado que sus propiedades extractivas son excelentes, lográndose recuperaciones superiores al 94% en la extracción de colorantes iónicos de muestras acuosas.
En el Capítulo II [6], la separación de fases en los sistemas coloidales de ramnolípidos se ha inducido mediante la neutralización de sus grupos carboxilato por adición de un ácido (HCl). La concentración mínima de ácido necesaria para la formación de este biodisolvente (0.01-0.5 M de HCl) es mucho menor que para los SUPRASs inducidos por ácido anteriormente desarrollados (2.5-5 M de HCl), en el intervalo de tensioactivo estudiado. En este caso, la adición de una mayor concentración de agente coacervante no tiene ningún efecto sobre la composición y el volumen del disolvente generado. En toda la región de coacervación la composición del bioSUPRAS es la misma, está formado únicamente por ramnolípido (80%, p/p) y agua. Las características de su estructura observadas mediante microscopía electrónica se corresponden con las de una fase esponja, junto con la cual coexisten vesículas de diferentes tamaños (desde nm hasta µm). Gracias a la gran cantidad de puentes de hidrógeno que pueden establecerse entre las moléculas de ramnolípido, y a la ausencia de repulsiones electrostáticas entre las mismas, las estructuras originadas tienen una alta cohesión y son estables frente a estímulos ambientales, a diferencia de los coacervados convencionales. Su capacidad para establecer numerosos puentes de hidrógeno también parece haber contribuido a las altas recuperaciones alcanzadas en la extracción de un conjunto de colorantes solubles en agua (>88%).
Bloque B. Desarrollo de estrategias innovadoras para la determinación de contaminantes emergentes En este segundo bloque, se han desarrollado dos métodos analíticos: uno para la determinación de bisfenoles en muestras de saliva y otro para la determinación de cianotoxinas en aguas continentales. Para ello, en primer lugar, se ha creado un método cromatográfico y de adquisición de datos que permite identificar y cuantificar los compuestos de interés mediante cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas de baja resolución, en el caso de los bisfenoles, y de alta resolución, para las cianotoxinas. A continuación, se ha diseñado un procedimiento simple para el tratamiento de muestra. Posteriormente, los métodos desarrollados se han validado según la normativa pertinente. Por último, se han analizado muestras reales para corroborar la efectividad de los métodos y obtener datos de la presencia de estos contaminantes en la naturaleza.
En el Capítulo III [7], se presenta por primera vez un método para la determinación de 13 bisfenoles y derivados clorados en saliva, una muestra biológica cuya recolección no es invasiva y no requiere de personal cualificado. Se ha conseguido desarrollar un procedimiento simple para el tratamiento de muestra, utilizando un SUPRAS con propiedades de acceso restringido que permite llevar a cabo de manera simultánea las etapas de extracción y purificación. Para la síntesis del coacervado simplemente hay que añadir a la muestra (1 mL) un pequeño volumen de hexanol (45 µL) y tetrahidrofurano (450 µL), y el agua de la propia saliva es la que actúa como agente coacervante. El método desarrollado no presenta efecto matriz, las recuperaciones globales alcanzadas son del 95-105.6% y los límites de cuantificación se encuentran en el intervalo 24-98 ng·L-1. Utilizando este método se han analizado muestras procedentes de 13 voluntarios. En todas ellas se ha encontrado bisfenol A (57-800 ng·L-1), además, en algunos de los participantes se han detectado bisfenoles S, F y AF (≤341 ng·L-1).
El método propuesto en el Capítulo IV [8], a diferencia de los desarrollados hasta el momento, aúna cuatro características fundamentales para realizar un buen control de los niveles de cianotoxinas en aguas: (1) tiene la capacidad de determinar de manera simultánea diferentes clases de cianotoxinas, (2) permite conocer de forma separada la concentración de cianotoxinas intra- y extracelulares, (3) el procedimiento de tratamiento de muestra es simple, y (4) utiliza espectrometría de masas de alta resolución, por lo que es un método con alta selectividad y que genera datos para el análisis retrospectivo de nuevas toxinas. La determinación de las cianotoxinas extracelulares no requiere tratamiento de muestra, el agua se inyecta directamente en el cromatógrafo tras ser filtrada. Las cianotoxinas intracelulares se determinan por separado en la biomasa liofilizada, tras una etapa de lisis celular y una extracción liquido-líquido con un pequeño volumen de metanol/agua. Las propiedades analíticas del método desarrollado cumplen los criterios de validación para un grupo de 9 cianotoxinas, incluyendo anatoxinas, cilindrospermopsina y microcistinas. Los límites de cuantificación del método, para una muestra de 50 mL, están comprendidos en los intervalos 8-45 y 25-129 ng·L-1 para las cianotoxinas intra- y extracelulares, respectivamente. En tres de los cuatro lagos incluidos en el estudio había presentes anatoxina-a, cilindrospermopsina y varias microcistinas. Cabe señalar que, en uno de ellos, la concentración de microcistinas (52 µg·L-1) era muy superior a los niveles considerados seguros por la Organización Mundial de la Salud (2-4 µg·L-1).
3. Conclusiones Los dos bioSUPRASs que se han desarrollado en esta Tesis son disolventes seguros y respetuosos con el medio ambiente, por lo que son una magnífica alternativa para reemplazar a los disolventes orgánicos usados tradicionalmente en procesos de extracción. Para su producción se usan tensioactivos naturales que son biodegradables y proceden de fuentes renovables, y otras sustancias inocuas. Los procedimientos de síntesis de estos biodisolventes son muy simples, se llevan a cabo a temperatura ambiente y su selectividad es muy alta, prácticamente todo el tensioactivo utilizado se incorpora al disolvente (>99%). Tienen una excelente capacidad de extracción, incluso pueden lograrse altos porcentajes de recuperación para compuestos muy polares disueltos en agua. Además, el proceso de extracción es rápido y se consume poco disolvente.
La realización de estas investigaciones ha aumentado el conocimiento sobre la coacervación de sistemas coloidales constituidos por agregados de biotensioactivos, que es un área prácticamente inexplorada, y ha abierto camino para su aplicación en procesos de extracción. En concreto, los bioSUPRASs que se forman en presencia de sales resultan especialmente adecuados para la extracción de compuestos en muestras que por su naturaleza ya contienen una elevada concentración de las mismas, como las aguas marinas y algunas aguas residuales procedentes de la industria textil o alimentaria. En relación a las características de los analitos, la extracción se verá favorecida para aquellos que posean cargas positivas, debido a las fuerzas atractivas que pueden establecerse con los grupos carboxilato de los ramnolípidos. Por otro lado, los bioSUPRASs de ramnolípido cuya formación se induce por la adición de un ácido pueden utilizarse para la purificación de aguas y otras aplicaciones que requieran el tratamiento de grandes volúmenes de muestra, gracias a su elevada estabilidad. La extracción será especialmente efectiva para aquellos compuestos con los que se puedan establecer numerosos puentes de hidrógeno.
Por otra parte, se han conseguido desarrollar métodos fiables y simples para la determinación de dos familias de contaminantes emergentes, cuyas propiedades son idóneas para ser utilizados en estudios a gran escala. Esto ha sido posible gracias al diseño de procedimientos de tratamiento de muestra muy efectivos, pero que implican un número reducido de etapas sencillas y rápidas, y su combinación con las técnicas de cromatografía de líquidos y espectrometría de masas. Todo ello ha permitido obtener métodos libres de efecto matriz, en los que la cuantificación se realiza mediante calibración externa. También cabe destacar el pequeño volumen de disolvente que se consume en ambos métodos para la extracción de los analitos: 197 µL de SUPRAS por muestra de saliva (1 mL) y 1.25 mL de metanol:agua (75:25, v/v) por muestra de agua (4-100 mL).
Existen evidencias de que estos dos grupos de compuestos, los bisfenoles y las cianotoxinas, son perjudiciales para la salud. Sin embargo, la legislación al respecto es muy escasa y únicamente incluye un número muy reducido del total de estos contaminantes. Los métodos desarrollados en la presente Tesis son una herramienta valiosa para obtener datos sobre la presencia y distribución de estas sustancias en la naturaleza, una información que es imprescindible para que los organismos reguladores puedan establecer restricciones sobre su uso. Asimismo, pueden resultar útiles para la monitorización rutinaria de estos contaminantes. Como se ha comprobado en los estudios realizados, la concentración de cianotoxinas en las aguas puede alcanzar valores que suponen un riesgo para la salud. Por tanto, sería conveniente hacer análisis periódicos en aquellos cuerpos de agua que estén destinados a la realización de actividades de recreo o que sean fuente de abastecimiento para plantas potabilizadoras. De esta forma, cuando se detectasen niveles elevados, podrían clausurarse estos espacios y ponerse en marcha procedimientos para reducir la población de cianobacterias. Además, pondría en alerta a las plantas potabilizadoras, de forma que pudiesen aplicar los tratamientos adecuados para evitar la distribución de agua contaminada.
4. Bibliografía [1] Pena-Pereira, F., Tobiszewski, M. (Eds.), 2017. The application of green solvents in separation processes. Elsevier.
[2] Rubio, S., 2020. Twenty years of supramolecular solvents in sample preparation for chromatography: achievements and challenges ahead. Anal. Bioanal. Chem. 412, 6037-6058.
[3] Chen, D., Kannan, K., Tan, H., Zheng, Z., Feng, Y.L., Wu, Y., Widelka, M., 2016. Bisphenol analogues other than BPA: environmental occurrence, human exposure, and toxicity-A review. Environ. Sci. Technol. 50, 5438-5453.
[4] Meriluoto, J., Spoof, L., Codd, G.A. (Eds.), 2017. Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. John Wiley & Sons, Ltd, Chichester.
[5] Romera-García, E., Ballesteros-Gómez, A., Rubio, S., 2020. Supramolecular biosolvents made up of self-assembled rhamnolipids: synthesis and characterization. Green Chem. 22, 6115-6126.
[6] Romera-García, E., Ballesteros-Gómez, A., Rubio, S., 2021. An environmentally stable supramolecular biosolvent: characterization and study of its potential for the elimination of polar toxic substances in water. J. Clean. Prod. 321, 128975.
[7] Romera-García, E., Caballero-Casero, N., Rubio, S., 2019. Saliva-induced coacervation of inverted aggregates of hexanol for simplifying human biomonitoring: Application to the determination of free bisphenols. Talanta. 204, 465-474.
[8] Romera-García, E., Helmus, R., Ballesteros-Gómez, A., Visser, P.M., 2021. Multi-class determination of intracellular and extracellular cyanotoxins in freshwater samples by ultra-high performance liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry. Chemosphere. 274, 129770.
