Resumen de Desarrollo de extractos funcionales de semillas de leguminosas y plantas nativas de Ecuador: Análisis de su capacidad antioxidante, preventiva y antitumoral
El cáncer colorrectal (CCR) es uno de los tumores más comunes en todo el mundo, representando el 10% de todos los tumores. En los próximos años, según la “International Agency for Research on Cancer -IARC”, la incidencia y mortalidad incrementará progresivamente convirtiéndose el CCR en la tercera causa de muerte por cáncer en varones y la segunda en mujeres. Son necesarias, por tanto, nuevas estrategias terapéuticas que permitan mejorar el pronóstico de estos pacientes disminuyendo las recidivas, las metástasis y la resistencia a quimioterapia que provocan las terapias actuales.Actualmente el CCR avanzado se trata habitualmente con quimioterapia (5-fluorouracilo (5-FU), oxaliplatino, cabecitabina, entre otros) y terapias dirigidas (cetuximab, Panitumumab bevacizumab entre otros) Sin embargo, la limitada eficacia clínica, el desarrollo de resistencia y efectos adversos suponen una grave limitación terapéutica del CCR. Por su parte las plantas y sus extractos poseen aplicaciones terapéuticas frente a células tumorales de cáncer de colon debido a la presencia de compuestos bioactivos que modulan vías de señalización, regulan la expresión génica e inducen apoptosis. Además, la combinación de estos componentes bioactivos con agentes quimioterapéuticos ha mostrado resultados favorables en el tratamiento del CCR relacionados con el control de los mecanismos de las vías metabólicas y mediante un efecto sinérgico que puede reducir el desarrollo de resistencias y reacciones adversas a los fármacos quimioterapéuticos. Las leguminosas son un alimento importante en nutrición humana y animal debido a su alto contenido en proteína, fibra, hidratos de carbono complejos, vitaminas, minerales y grasa mayoritariamente poliinsaturada. Además, en los últimos años han ganado interés nutricional debido a que su consumo contribuye a la prevención de otras enfermedades como las cardiovasculares o la diabetes mellitus tipo 2. De igual forma, algunas plantas tradicionales cultivadas en Ecuador como Tropaeolum tuberosum, Annona cherimola y Moringa oleifera han sido empleadas como medicina tradicional durante muchos años debido a sus propiedades terapéuticas en el tratamiento de enfermedades pulmonares, cutáneas, renales, enfermedades parasitarias, diabetes, úlceras pépticas y cáncer. Su actividad terapéutica se basa en la presencia de compuestos bioactivos como alcaloides, polifenoles y terpenoides, entre otros componentes bioactivos. El objetivo de la presente tesis doctoral se centró en el estudio de la actividad antioxidante y antitumoral presente en los extractos etanólicos e hidrolizados proteicos de leguminosas y de las especies de Tropaeolum tuberosum, Annona cherimola y Moringa oleifera en líneas celulares de CCR, así como identificar los mecanismos de acción por los cuales estos extractos inducen muerte celular. Con el objetivo de caracterizar la actividad antioxidante que presentaban los extractos funcionales, se determinó la capacidad antioxidante de los extractos utilizando diferentes pruebas bioquímicas y una línea celular de adenocarcinoma de colon (HT-29). Asimismo, se analizó la actividad antitumoral in vitro en tres líneas tumorales de cáncer de colon (T84, HCT-15, SW440), en una línea de epitelio de colon no tumoral (CCD18) y en un modelo de esferoides tumorales multicelulares (MTS). Además, se evaluó la actividad sinérgica entre los extractos funcionales con el agente quimioterapéutico 5-FU y se llevaron a cabo estudios cromatográficos para identificar los potenciales compuestos bioactivos presentes en los extractos responsables de dicha actividad antioxidante y antitumoral. Finalmente se realizaron ensayos más específicos para determinar los mecanismos de acción por el cual actúan los diferentes extractos funcionales, como es el ensayo del ciclo celular por citometría de flujo mediante tinción con yoduro de propidio, estudios de western blot para determinar la activación de las caspasas, estudios de autofagia mediante Lysotracker e identificación de la forma LC3-β2, producción de especies reactivas de oxígeno mediante citometría de flujo con tinción DCFDA/H2DCFDA y estudios de RT-qPCR para determinar marcadores de células madre tumorales (CSCs).Los resultados obtenidos ponen de manifiesto la actividad antioxidante de los extractos funcionales de Vicia faba, Vicia narbonensis y Medicago Sativa y su capacidad para inhibir la proliferación celular de las líneas de cáncer de colon T84 y SW480, así como de estimular la producción de las enzimas detoxificantes glutatión S-transferasa y quinona oxidorreductasa.Con respecto a las especies Tropaeolum tuberosum, Annona cherimola y Moringa oleifera. El extracto de Annona cherimola mostró la mayor actividad antioxidante, mientras que la Moringa oleifera mostró la mayor capacidad de potenciar la actividad de enzimas detoxificantes como la glutatión S-transferasa y la quinona oxidorreductasa. Además, estos dos extractos presentaron la menor IC50 en las células T-84 y HCT-15 (resistente), así como el mayor nivel de inhibición de la proliferación en esferoides tumorales multicelulares de células HCT-15. El efecto inhibidor sobre las CSC es digno de mención porque, in vivo, estas células suelen ser responsables de las recidivas del cáncer y de la resistencia a la quimioterapia. Además, todos los extractos mostraron una actividad sinérgica con el 5-FU. El mecanismo antiproliferativo de los extractos se relacionó con la sobreexpresión de las caspasas 9, 8 y 3 y el aumento de la producción de especies reactivas de oxígeno. Además, se observó muerte celular por autofagia inducida por los extractos de Moringa oleifera y Tropaeolum tuberosum. Como conclusión, cabe destacar la actividad antioxidante y antitumoral de los extractos funcionales obtenidos, los cuales son excelentes candidatos para futuros análisis moleculares de la presencia de compuestos bioactivos y estudios in vivo que podrían mejorar la terapia del cáncer de colon.Colorectal cancer (CRC) is one of the most common tumors worldwide, representing 10% of all tumors. In the coming years, according to the International Agency for Research on Cancer (IARC), the incidence and mortality rate will increase progressively, making CRC the third leading cause of cancer death in men and the second in women. Therefore, new therapeutic strategies are needed to improve the prognosis of these patients by reducing recurrences, metastasis and resistance to chemotherapy caused by current therapies.Currently, advanced CRC is usually treated with chemotherapy (5-fluorouracil (5-FU), oxaliplatin, cabecitabine, among others) and targeted therapies (cetuximab, Panitumumab, bevacizumab, among others). However, the limited clinical efficacy, the development of resistance and adverse effects represent a serious therapeutic limitation of CRC. On the other hand, plants and their extracts have therapeutic applications against colon cancer tumor cells due to the presence of bioactive compounds that modulate signaling pathways, regulate gene expression and induce apoptosis. In addition, the combination of these bioactive compounds with chemotherapeutic agents has shown favorable results in the treatment of CRC related to the control of metabolic pathway mechanisms and through a synergistic effect that can reduce the development of resistance and adverse reactions to chemotherapeutic drugs. Legumes are an important food in human and animal nutrition due to their high content of protein, fiber, complex carbohydrates, vitamins, minerals and mostly polyunsaturated fat. In addition, in recent years they have gained nutritional interest due to the fact that their consumption contributes to the prevention of other diseases such as cardiovascular diseases or type 2 diabetes mellitus. Similarly, some traditional plants cultivated in Ecuador such as Tropaeolum tuberosum, Annona cherimola and Moringa oleifera have been used as traditional medicine for many years due to their therapeutic properties in the treatment of pulmonary, skin, kidney, parasitic diseases, diabetes, peptic ulcers and cancer. Its therapeutic activity is based on the presence of bioactive compounds such as alkaloids, polyphenols and terpenoids, among other bioactive components. The objective of this doctoral thesis focused on the study of the antioxidant and antitumor activity present in ethanolic extracts and protein hydrolysates of legumes and Tropaeolum tuberosum, Annona cherimola and Moringa oleifera species in CRC cell lines, as well as to identify the mechanisms of action by which these extracts induce cell death. In order to characterize the antioxidant activity of the functional extracts, the antioxidant capacity of the extracts was determined using different biochemical tests and a colon adenocarcinoma cell line (HT-29). In vitro antitumor activity was also analyzed in three colon cancer tumor lines (T84, HCT-15, SW440), in a non-tumor colon epithelium line (CCD18) and in a multicellular tumor spheroid model (MTS). In addition, the synergistic activity between the functional extracts with the chemotherapeutic agent 5-FU was evaluated and chromatographic studies were carried out to identify potential bioactive compounds present in the extracts responsible for such antioxidant and antitumor activity. Finally, more specific assays were performed to determine the mechanisms of action by which the different functional extracts act, such as the cell cycle assay by flow cytometry using propidium iodide staining, western blot studies to determine the activation of caspases, autophagy studies by Lysotracker and identification of the LC3-β2 form, reactive oxygen species production by flow cytometry with DCFDA/H2DCFDA staining and RT-qPCR studies to determine tumor stem cell (CSCs) markers.The results obtained show the antioxidant activity of functional extracts of Vicia faba, Vicia narbonensis and Medicago Sativa and their ability to inhibit cell proliferation of colon cancer lines T84 and SW480, as well as to stimulate the production of the detoxifying enzymes glutathione S-transferase and quinone oxidoreductase.With respect to Tropaeolum tuberosum, Annona cherimola and Moringa oleifera species. Annona cherimola extract showed the highest antioxidant activity, while Moringa oleifera showed the highest capacity to enhance the activity of detoxifying enzymes such as glutathione S-transferase and quinone oxidoreductase. In addition, these two extracts presented the lowest IC50 in T-84 and HCT-15 (resistant) cells, as well as the highest level of inhibition of proliferation in multicellular tumor spheroids of HCT-15 cells. The inhibitory effect on CSCs is noteworthy because, in vivo, these cells are often responsible for cancer recurrences and resistance to chemotherapy. Moreover, all extracts showed synergistic activity with 5-FU. The antiproliferative mechanism of the extracts was related to overexpression of caspases 9, 8 and 3 and increased production of reactive oxygen species. In addition, cell death by autophagy induced by Moringa oleifera and Tropaeolum tuberosum extracts was observed. In conclusion, the antioxidant and antitumor activity of the functional extracts obtained is noteworthy, which are excellent candidates for future molecular analysis of the presence of bioactive compounds and in vivo studies that could improve colon cancer therapy.
