Functional analysis of a truncating variant of RAD51B and two ultraconserved genomic elements in gametogenesis
- Autores: Yazmine Bejarano Condezo
- Directores de la Tesis: Jose Alberto Martín Pendás (dir. tes.), Elena Llano Cuadra (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Salamanca ( España ) en 2022
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: José Ayté del Olmo (presid.), Cristina Martín Castellanos (secret.), Ignasi Roig Navarro (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biociencias: Biología y Clínica del Cáncer y Medicina Traslacional por la Universidad de Salamanca
- Materias:
- Enlaces
- Resumen
- español
La gametogénesis de mamíferos, cuyo objetivo final es generar gametos haploides a partir de células diploides, representa uno de los procesos de diferenciación más complejos en la biología del desarrollo y requiere una regulación precisa de la expresión génica. Si bien se ha generado un vasto conocimiento en este campo a lo largo de décadas, aún quedan por comprender a fondo varios aspectos en cuanto a su regulación. En la presente tesis se ha llevado a cabo el análisis funcional de una familia con infertilidad hereditaria y dos elementos ultraconservados de mamíferos, HS205 y HS1442, potencialmente implicados en la gametogénesis. La insuficiencia ovárica primaria (POI, por sus siglas en inglés) causa infertilidad femenina al anular la función ovárica normal. Aunque la etiología genética de este trastorno se ha investigado ampliamente, la mayoría de los casos de POI siguen sin explicación. RAD51B es un miembro de la familia de recombinasas RAD51. Los resultados de la secuenciación del exoma completo de una familia con POI identificaron una variante truncada homocigótica en RAD51B-(c.92delT) en dos hermanas afectadas. Los estudios in vitro revelaron que esta variante conduce al reinicio de la traducción en el codón 64 de AUG. Aquí mostramos que se trata de una variante hipomórfica patógena en un modelo de ratón. Los ratones Rad51bc.92delT/c.92delT exhibieron defectos de reparación del ADN meiótico debido a la acumulación de γH2AX, RAD51 y HSF2BP/BMRE1 en los ejes cromosómicos, lo que provocó una reducción en el número de entrecruzamientos. Curiosamente, la interacción de RAD51B-c.92delT con RAD51C y con sus interactores recientemente identificados RAD51 y HELQ fue anulada o disminuida. La reparación de las aberraciones cromosómicas inducidas por mitomicina-C se vio afectada in vitro en células somáticas humanas y de ratón RAD51B/Rad51b-c.92delT y en células de médula ósea de ratón explantadas. En consecuencia, la variante RAD51B-c.92delT redujo la eficiencia de reprogramación pluripotente de los fibroblastos embrionarios de ratón primarios. Finalmente, los ratones Rad51bc.92delT/c.92delT mostraron una mayor incidencia de hiperplasia de la glándula pituitaria. Estos resultados proporcionan nuevos conocimientos sobre el mecanismo del papel de RAD51B no solo en la meiosis sino también en el mantenimiento de la estabilidad del genoma somático. Los elementos ultraconservados son secuencias genómicas que muestran niveles extremadamente altos de similitud entre especies distantes. Hasta la fecha, no se ha propuesto ninguna explicación funcional convincente que resulte en un nivel tan alto de conservación. Sin embargo, la distribución de estos elementos dentro y entre los genomas de vertebrados sugiere que podrían tener muchas funciones como elementos reguladores de la transcripción durante la diferenciación asociada con el desarrollo. Para explorar directamente un papel funcional de estos elementos ultraconservados en la regulación de la espermatogénesis, se han seleccionado dos elementos ultraconservados, HS205 y HS1442, potencialmente involucrados en la biología de las células germinales según su actividad potenciadora restringida durante el desarrollo del ratón hasta el tubérculo genital. Con el fin de analizar su papel, se ha caracterizado su actividad potenciadora tanto in vitro en diferentes tipos de células como in vivo mediante electroporación testicular. Además, se ha eliminado hs205 y hs1442 en el ratón utilizando el sistema CRISPR/Cas9 y analizado sus consecuencias durante la espermatogénesis. Los resultados proporcionan evidencia in vivo de que HS205 y HS1442 no son esenciales para la gametogénesis masculina y, por lo tanto, para la fertilidad en el ratón.
- English
Mammalian gametogenesis, whose ultimate aim is to generate haploid gametes from diploid cells, represents one of the most complex differentiation processes in developmental biology and requires an accurate regulation of gene expression. Although a vast knowledge has been generated in this field throughout decades, several aspects regarding its regulation are still far away to be thoroughly understood In the present thesis, we have carried out functional analysis of a family with hereditary infertility and two mammalian ultraconserved elements, HS205 and HS1442, potentially involved in gametogenesis.
Primary ovarian insufficiency (POI) causes female infertility by abolishing normal ovarian function. Although the genetic etiology of this disorder has been extensively investigated, most POI cases remain unexplained. RAD51B is a member of the RAD51 family of recombinases. Results of whole-exome sequencing of a family with POI identified a homozygous truncating variant in RAD51B-(c.92delT) in two affected sisters. In vitro studies revealed that this variant leads to translation reinitiation at AUG codon 64. Here, we show that this is a pathogenic hypomorphic variant in a mouse model. Rad51bc.92delT/c.92delT mice exhibited meiotic DNA repair defects due to γH2AX, RAD51 and HSF2BP/BMRE1 accumulation in the chromosome axes leading to a reduction in the number of crossovers. Interestingly, the interaction of RAD51B-c.92delT with RAD51C and with its newly identified interactors RAD51 and HELQ was abrogated or diminished. Repair of Mitomycin-C-induced chromosomal aberrations was impaired in RAD51B/Rad51b-c.92delT human and mouse somatic cells in vitro and in explanted mouse bone marrow cells. Accordingly, RAD51B-c.92delT variant reduced pluripotent reprogramming efficiency of primary mouse embryonic fibroblasts. Finally, Rad51bc.92delT/c.92delT mice displayed increased incidence of pituitary gland hyperplasia. These results provide new mechanistic insights into the role of RAD51B not only in meiosis but in the maintenance of somatic genome stability.
Ultraconserved elements are genomic sequences showing extremely high levels of similarity across distant species. To date, no compelling functional explanation has been proposed which would result in such high level of conservation. However, the distribution of these elements within and across vertebrate genomes suggest that they could have many roles as transcriptional regulatory elements during the differentiation associated with development. To directly explore a functional role of these ultraconserved elements in the regulation of spermatogenesis, we have selected two ultraconserved elements, HS205 and HS1442, potentially involved in germ cell biology according to its restricted enhancer activity during mouse development to the genital tubercle. In order to analyze their role, we have further characterized its enhancer activity either in vitro different cell types, and in vivo by testis electroporation. In addition, we have deleted both hs205 and hs1442 in the mouse using CRISPR/Cas9 system and analyzed its consequences during spermatogenesis. Our results provide in vivo evidence that HS205 and HS1442 are not essential for male gametogenesis and thus, fertility in the mouse.
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