Molecular determinants of strand displacement polymerization by HIV reverse transcriptases

• Autores: Mara Martín Alonso
• Directores de la Tesis: Luis Menéndez Arias (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2022
• Idioma: inglés
• Número de páginas: 163
• Títulos paralelos:
  • Determinantes moleculares del desplazamiento de banda en la polimerización de DNA catalizada por transcriptasas inversas del VIH
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen
  • español

    En retrovirus, el desplazamiento de banda en la polimerización del ADN catalizada por la transcriptasa inversa (RT) es necesario para sintetizar el ADN proviral de doble cadena. Esta actividad también es crucial para generar ADNc de alta calidad para su uso en biotecnología. Después de cribar un panel de enzimas purificadas, se han identificado varias RTs del VIH con un fenotipo de desplazamiento de banda defectuoso utilizando ADN y ARN como moldes. Las RTs del VIH-2ROD con menor capacidad de desplazamiento de banda contenían una o más sustituciones de aminoácidos en el subdominio fingers, incluidas mutaciones asociadas a resistencia a análogos de timidina (TAMs). Combinaciones de diferentes TAMs en el VIH-1 (i.e. M41L, D67N, K70R, L210W o T215F/Y) confieren resistencia a zidovudina y otros análogos de timidina y se han asociado a la resistencia al tratamiento antirretroviral. Sin embargo, rara vez se encuentran en el VIH-2. Los mayores defectos de desplazamiento de banda y las menores tasas de incorporación de nucleótido se obtuvieron en reacciones catalizadas por las RTs mutantes del VIH-2ROD D67N/K70R/S215Y y M41L/D67N/K70R/S215Y en condiciones de desplazamiento de banda. En el VIH-1, la presencia de TAMs no tuvo ningún efecto sobre la actividad de desplazamiento de banda. En cambio, la pérdida de la actividad RNasa H por inactivación mutacional (p. ej. con las sustituciones D443N o E478Q) produjo un defecto pronunciado en el desplazamiento de banda cuando se utilizaron moldes de ARN, que no se observó con moldes ADN. Efectos similares fueron obtenidos usando β-thujaplicinol y otros inhibidores del centro activo de la RNasa H previamente caracterizados. Algunos de ellos eran también inhibidores de la integrasa del VIH-1 y/o de la ADN polimerasa de la RT viral. Entre ellos, inhibidores duales de las actividades ADN polimerasa/RNasa H de la RT, que contienen un farmacóforo 7-hidroxi-6- nitro-2H-cromo-2-ona (como los derivados de cumarina DW3 y K04-9), fueron los inhibidores más potentes del desplazamiento de banda. Por último, la detección de modificaciones del ARN y su localización precisa es un campo de gran interés actualmente, pero lleno de escollos técnicos durante la preparación de librerías de ARN debido a la incapacidad de la RT para formar pares de bases con algunas bases modificadas. La RT del MMLV ProtoScript II mostró una gran reducción de las tasas de error en los sitios modificados analizados al aumentar la temperatura de reacción. Mientras que las RTs del VIH mostraron tasas de error más altas e introdujeron un mayor número de deleciones comparadas con MMLV ProtoScript II. Estos datos sugieren la alta procesividad y capacidad de lectura de las RTs del VIH para su uso en secuenciación de ARN utilizando moldes modificados

  • English

    In retroviruses, strand displacement DNA polymerization catalyzed by the reverse transcriptase (RT) is needed for synthesizing double-stranded proviral DNA. This activity is also critical to generate high-quality cDNA for use in biotechnology. After screening a panel of purified enzymes, several HIV RTs with a defective strand displacement phenotype have been identified using DNA and RNA as templates. Defective strand displacement HIV-2ROD RTs contained one or more amino acid substitutions in the fingers subdomain, including thymidine analogue resistance-associated mutations (TAMs). Combinations of different TAMs in HIV-1 (i.e., M41L, D67N, K70R, L210W, or T215F/Y) confer resistance to zidovudine and other thymidine analogues and have been associated with resistance to the antiretroviral treatment. However, they are rarely found in HIV-2. Results revealed that the largest defects in strand displacement and the lowest nucleotide incorporation rates were obtained in reactions catalyzed by HIV-2ROD RT mutants D67N/K70R/S215Y and M41L/D67N/K70R/S215Y, under strand displacement conditions. In HIV-1, the presence of TAMs had no effect on strand displacement activity. In contrast, loss of RNase H activity by mutational inactivation (e.g., substitutions D443N or E478Q) produced a pronounced defect on strand displacement when using RNA templates that was not observed with DNA templates. Similar effects were obtained using β-thujaplicinol and other previously characterized RNase H active site inhibitors. Some of them were also inhibitors of the HIV-1 integrase and/or the viral RT DNA polymerase. Among them, dual inhibitors of RT DNA polymerase/RNase H activities, containing a 7-hydroxy-6-nitro-2Hchromen- 2-one pharmacophore (coumarin derivatives DW3 and K04-9) were the most potent strand displacement inhibitors. Finally, RNA modification detection and their precise localization is currently a field of high interest but fraught with technical pitfalls during RNA libraries preparation due to the inability of the RTs to form a base pair with some modified bases. MMLV ProtoScript II RT showed a large reduction of the mismatch rates at modified sites tested as the reaction temperature increases. While HIV RTs exhibited higher mismatch rates and introduced a higher number of deletions compared to MMLV ProtoScript II. These data suggest the high processivity and read-through capability of the HIV RTs for use in RNA sequencing when using modified templates