Single molecule optical microscopy for the quantitative study of protein-lipid interactions
- Autores: Arturo Daniel García Vesga
- Directores de la Tesis: J. Requejo-Isidro (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2022
- Idioma: inglés
- Número de páginas: 179
- Títulos paralelos:
- Microscopía de molécula individual para el estudio cuantitativo de la interacción entre proteínas y lípidos
- Tribunal Calificador de la Tesis: Manuel José Prieto Montt (presid.), Pedro José de Pablo Gómez (secret.), María del Pilar Lillo Villalobos (voc.), Sophie Brasselet (voc.), Cristina Flors Ong (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Física de la Materia Condensada, Nanociencia y Biofísica por la Universidad Autónoma de Madrid; la Universidad de Murcia y la Universidad de Oviedo
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
- Resumen
Las interacciones lípido proteína son omnipresentes en la naturaleza y juegan un papel primordial en las células y su funcionamiento fisiológico. Asimismo, en estas interacciones, las proteínas pueden interactuar específica y no específicamente con los lípidos. Tradicionalmente, estas interacciones han sido estudiadas con técnicas que, bien son incapaces de medir la interacción con las moléculas en su estado nativo, o bien la información que proporcionan es demasiado compleja como para poder entender y desacoplar los mecanismos que rigen la interacción. La microscopía óptica de molécula individual es capaz de sobrepasar estas limitaciones, ya que permite el estudio de las interacciones preservando su estado nativo y con muy pocas modificaciones en el sistema. Además, pueden resolver interacciones con una alta resolución temporal y espacial. En esta tesis se propone el uso de tres metodologías de microscopía óptica de molécula individual para el estudio de interacciones entre anticuerpos anti-VIH, proteínas de envuelta del VIH y membranas lipídicas.
Para comenzar, se ha usado la técnica de correlación de la emisión fluorescente (FCS) de dos componentes para cuantificar la intensidad del reparto de anticuerpos en vesículas de lípido, desnudas o decoradas con un epítopo similar al del VIH. Para determinar la fuerza de la interacción del anticuerpo con la membrana y la unión específica al epítopo se usaron vesículas con diferentes composiciones de lípido. Ya que no existe una metodología experimental estándar, se han desarrollado una serie de protocolos experimentales y computacionales para analizar la asociación de anticuerpos y vesículas. En particular, como el análisis de FCS de dos componentes es muy sensible al número de anticuerpos asociados a cada vesícula, se ha propuesto una distribución de probabilidad que describe el reparto de anticuerpos en vesículas en condiciones de equilibrio y se ha usado para estimar el coeficiente de reparto. El modelo experimental propuesto se ha ensayado con simulaciones y análisis teóricos para evaluar y estimar su precisión.
Para estudiar la interacción a escala nanométrica, se han usado dos técnicas de superresolución. Primero se ha estudiado la interacción entre la proteína de envuelta del VIH, que está parcialmente inserta en la membrana del virus, y su entorno lipídico con una novedosa técnica que mide la orientación en 3D de moléculas individuales. Esta técnica, que está basada en microscopía de luz polarizada, es capaz de cuantificar el desorden estructural de sondas fluorescentes incrustadas en la membrana. Gracias a la combinación de esta técnica con un análisis de clusters basado en aprendizaje de máquina se ha podido medir la influencia de la proteína transmembrana en la organización vertical de los lípidos de su entorno. Finalmente, se ha medido la intensidad de la interacción entre anticuerpos y membranas con la ayuda de una técnica de seguimiento de molécula individual (SMT) que ha permitido visualizar eventos de interacción individualmente. La técnica SMT también permite determinar la constante de difusión de anticuerpos difundiendo en membranas lipídicas soportadas y es capaz de medir los cambios en la interacción como consecuencia de cambios en las propiedades electrostáticas o hidrofóbicas de la membrana. Estos enfoques han permitido evidenciar y cuantificar la influencia mutua entre proteínas y lípidos en la membrana. Asimismo, las aplicaciones y los protocolos desarrollados en esta tesis pueden extenderse a muchos otros sistemas de interacción entre proteínas y membranas.
----------------------------- Título de la Tesis (en inglés): Single molecule optical microscopy for the quantitative study of protein-lipid interactions Protein-lipid interactions are ubiquitous in nature and play a major role in cells and their physiological functions. Most importantly, proteins may interact with lipid membranes both specifically and non specifically. Traditionally, these interactions have been assessed with techniques that either lack the ability to evaluate the interaction with the molecules in their native state, or their output is too complex to infer and uncouple the underlying mechanisms of the interaction. To overcome these limitations, single molecule optical microscopy is very convenient since it allows the study of these interactions while preserving the molecules in their native state with little or no modification. Furthermore, they can resolve the interactions with nanometric scale and with high time resolution. In this thesis I propose three single molecule optical microscopy methodologies to assess the non specific interactions between anti-HIV antibodies, HIV envelope protein and lipid membranes.
First, two component fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is used to quantify the partitioning strength of antibodies to lipid vesicles, naked or decorated with HIV like epitope. To discern the strength of the non specific interaction of the antibody with the membrane and the specific binding to the epitope, vesicles with different lipid compositions are used. Due to the absence of an established experimental methodology, I developed several experimental and computational protocols to analyse the association of antibodies and vesicles. In particular, since the two-component FCS analysis is very sensitive to the number of antibodies bound to the vesicles, I propose a probability distribution that describes the partitioning of antibodies in the vesicles at equilibrium and use it to estimate the partition constant. The experimental model is tested with simulations and theoretical analysis to evaluate and estimate its accuracy.
To examine the association at a nanometric scale, I used two super resolution techniques. I have first addressed the interaction between the HIV envelope protein, which is partially embedded in the membrane, and its lipid environment with a newly developed single molecule 3D orientation technique. This technique, based on polarized microscopy, is able to quantify orientational disorder of lipid probes in the membrane. In combination with a machine learning based cluster analysis, it is able to measure the influence of transmembrane proteins in the lateral organisation of their surrounding lipids. Finally, I measured the strength of membrane antibody interactions with single molecule tracking (SMT) by directly visualizing individual interaction events. SMT also allows the determination of the diffusion constant of antibodies diffusing in supported lipid bilayers and is able to characterize changes in the interaction as the electrostatic characteristics of the membrane or antibodies are modified. These approaches allow to evidence and quantify the range of mutual influence between proteins and lipids in the membrane. Furthermore, the applications and workflows developed in this thesis can be extended to many other protein membrane interacting systems.
