Nuevos conocimientos moleculares sobre el papel de la desregulación del proceso de splicing en cáncer
- Autores: María Alos
- Directores de la Tesis: Justo Castaño (dir. tes.), Rául Miguel Luque Huertas (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Córdoba (ESP) ( España ) en 2022
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Francisco Gracia Navarro (presid.), Maria Chiara Zatelli (secret.), Juan Valcárcel Juárez (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biomedicina por la Universidad de Córdoba
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: Helvia
- Resumen
1. Introducción o motivación de la tesis El cáncer y las enfermedades tumorales representan uno de los problemas de salud pública más graves y complicados, siendo una de las principales causas de muerte en el mundo [1]. La notable variedad entre los tipos de cáncer y la heterogeneidad entre los pacientes con la misma patología tumoral es una de las limitaciones más relevantes en la investigación del cáncer. Esta heterogeneidad es el resultado de la interacción de múltiples elementos que residen en diferentes niveles, desde la localización anatómica del tumor hasta las características clinicopatológicas, la funcionalidad, los marcadores celulares-moleculares y las alteraciones genético-epigenéticas. Aunque los recientes avances en la caracterización molecular de diferentes patologías tumorales han permitido mejorar su taxonomía y explorar sus bases genéticas, el impacto traslacional de estos nuevos conocimientos sigue siendo limitado. Este es el caso de los tres tipos distintos de cáncer que han centrado la atención de la presente Tesis Doctoral: los tumores neuroendocrinos pancreáticos (PanNETs) y dos tipos de adenocarcinomas, el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) y el cáncer de próstata (PCa).
Estas patologías tumorales constituyen ejemplos típicos de la complejidad del cáncer y de cómo los inicialmente escasos conocimientos moleculares han crecido hasta proporcionar herramientas útiles. De hecho, los tratamientos dirigidos molecularmente han tenido un notable éxito clínico en el tratamiento de una amplia gama de cánceres, como el PanNET, el PDAC y el PCa [2-4]. Sin embargo, los conocimientos y los tratamientos disponibles siguen siendo claramente insuficientes para abordar estas enfermedades y es necesario explorar nuevos mecanismos moleculares para encontrar herramientas adicionales. En este escenario, la alteración del splicing alternativo está emergiendo como un nuevo hallmark transversal del cáncer, que impregna todos los hallmark establecidos y proporciona atractivas dianas terapéuticas [5-7].
El splicing es un proceso esencial en la compleja regulación de la expresión génica, ya que permite el procesamiento adecuado del ARN y, por tanto, mantiene el correcto desarrollo y la homeostasis del individuo [8, 9]. El spliceosoma, la maquinaria molecular que lleva a cabo y regula el proceso de splicing, está compuesto por un conjunto discreto de ribonucleoproteínas que interactúan estrechamente con un gran grupo de proteínas, los factores de splicing [10]. El proceso de splicing y sus sistemas reguladores asociados son puntos clave en el control de funciones celulares esenciales, y su alteración puede tener consecuencias patológicas. La importancia fisiopatológica primordial del splicing alternativo y sus procesos asociados está respaldada por la evidencia emergente que vincula diversas anomalías del splicing (elementos spliceosómicos mutados o desregulados: componentes del spliceosoma, factores de splicing o variantes de splicing) con múltiples patologías, desde enfermedades raras hasta cánceres comunes, en las que se ha demostrado la función patogénica de los elementos spliceosómicos y su valor como objetivos terapéuticos En particular, el creciente número y la relevancia de los estudios que vinculan los defectos en los mecanismos relacionados con el splicing y el cáncer son abrumadores, apoyando inequívocamente su papel clave en la oncogénesis y la agresividad tumoral [11-16].
Sobre la base de toda la información mencionada, el objetivo general de esta Tesis Doctoral fue explorar la potencial desregulación de los componentes de la maquinaria de splicing en el cáncer, con el propósito final de descubrir nuevos biomarcadores y dianas farmacológicas con potencial para mejorar los enfoques diagnósticos y terapéuticos en estas patologías tumorales.
2. Contenido de la investigación Para lograr el objetivo mencionado, esta Tesis ha sido divida en tres secciones experimentales.
La primera sección de esta tesis doctoral se centró en los tumores neuroendocrinos pancreáticos (PanNETs), donde nuestro anterior trabajo desveló las propiedades oncogénicas de las variantes de splicing. Nuestro objetivo era evaluar la desregulación y el papel funcional del factor de splicing CELF4 en los PanNETs, así como evaluar su potencial papel como nuevo marcador de diagnóstico y objetivo de tratamiento en esta patología. Se evaluó la expresión de CELF4 en una cohorte de 20 pacientes con PanNET, comparando el tejido tumoral y el adyacente no tumoral, lo que reveló una marcada sobreexpresión, que se confirmó mediante un análisis biocomputacional en un conjunto de datos de RNA-Seq, en el que investigamos más a fondo CELF4, explorando sus relaciones con las características clínicas, la expresión génica y los perfiles de eventos de splicing. Además, se emplearon dos líneas celulares modelo de PanNET, BON-1 y QGP-1, para evaluar la función de CELF4 in vitro, incluyendo un array de fosforilación de proteínas de la ruta mTOR, e in vivo en ratones xenógrafos con la línea celular BON-1. La sobreexpresión de CELF4 se asoció estrechamente con características relevantes de malignidad, expresión específica de actores tumorales clave (por ejemplo, TP53) y perfiles distintos de eventos de splicing. En consecuencia, se observaron desregulaciones funcionales tras la modulación de CELF4 en las líneas celulares de PanNET en términos de proliferación in vitro, y su silenciamiento in vivo también redujo el crecimiento tumoral del xenoinjerto de BON-1. Curiosamente, la modulación de la expresión de CELF4 en las células PanNET influyó en su respuesta al inhibidor de mTOR everolimus, una vía cuyos intermediarios se vieron alterados de manera notable tras el silenciamiento de CELF4.
La segunda sección se dividió en dos partes, con el objetivo de explorar diferentes aspectos de la desregulación de la maquinaria de splicing en dos adenocarcinomas distintos pero relacionados. En primer lugar, nos propusimos determinar el estado de la maquinaria de splicing y su relación con las características clínicas y moleculares de la agresividad del PDAC. Para ello, medimos la expresión de 45 componentes seleccionados de la maquinaria de splicing en tejidos tumorales frente a sus tejidos adyacente no tumorales de un conjunto de 79 muestras de PDAC fijadas en formol e incluidas en parafina. Los análisis de la supervivencia de los pacientes y los parámetros clínicos en relación con la expresión de estos elementos de splicing condujeron a la identificación de un subconjunto de 2 factores de splicing desregulados, PRPF8 y RBMX, cuya expresión estaba estrechamente relacionada con el mal pronóstico y los parámetros de malignidad, e incluso asociada con la presencia de mutaciones en genes clave implicados en el desarrollo y la progresión del PDAC. Estos resultados se confirmaron en cohortes independientes de bases de datos públicas. La modulación experimental de estos factores de splicing en líneas celulares de PDAC (Capan-2, y BxPC-3) revirtió su expresión a niveles no tumorales, y dio lugar a una disminución de las características clave relacionadas con el tumor, incluyendo la proliferación celular, la migración y la formación de colonias. En el segundo estudio, investigamos el factor de splicing SRSF2 en el adenocarcinoma de próstata (PCa) y el adenocarcinoma de páncreas (PDAC), como potencial biomarcador de diagnóstico y diana terapéutica. Para ello, medimos los niveles de SRSF2 en muestras de tumores humanos de PCa y PDAC y en líneas celulares, y modificamos su expresión para evaluar diferentes criterios funcionales. Curiosamente, SRSF2 estaba sobreexpresado en las muestras tumorales con respecto al tejido no tumoral tanto en el PCa como en el PDAC, donde los niveles de SRSF2 se relacionaron de forma similar con las características clínico-moleculares que sugieren un potencial peor pronóstico y capacidad oncogénica. En relación con lo anterior, el silenciamiento de SRSF2 en líneas celulares modelo representativas de ambos adenocarcinomas inhibió la migración celular, la proliferación, la invasión y la formación de colonias en las líneas celulares de PCa, mientras que sólo causó una reducción igualmente pronunciada en la formación de colonias en las líneas celulares de PDAC. Estos hallazgos sugieren la interesante posibilidad de que SRSF2 pueda estar implicado en la regulación de la capacidad de iniciación tumoral, que está relacionada con las células madre del cáncer (CSC) dentro de la población celular.
La última sección de esta Tesis se centró en la exploración de la presencia y el papel funcional del factor central de splicing SF3B1 en PDAC y se interrogó su potencial como un objetivo accionable. Se analizó SF3B1 en los tejidos de PDAC, en un conjunto de datos de RNA-Seq y en bases de datos disponibles públicamente, examinando las asociaciones con las alteraciones de splicing y las características/genes clave. Los ensayos funcionales en líneas celulares de PDAC y CSCs derivadas de PDX sirvieron para probar los efectos del tratamiento con Pladienolide-B en líneas celulares modelo in vitro, e in vivo en dos modelos preclínicos (pez cebra y ratón). Descubrimos que SF3B1 se sobreexpresa en PDAC humano, donde se correlacionó con el grado del tumor y la afectación de los ganglios linfáticos. Los niveles de SF3B1 se asociaron estrechamente con distintos perfiles de eventos de splicing y con la expresión de genes clave del PDAC (KRAS, TP53). En las células de PDAC, Pladienolide-B aumentó la apoptosis y disminuyó múltiples características relacionadas con el tumor, incluyendo la proliferación celular, la migración y la formación de colonias/esferas, alterando la señalización de AKT y JNK, y favoreciendo la expresión de las variantes de splicing proapoptóticas (BCL-XS/BCL-XL, KRASa/KRAS, Δ133TP53/TP53). Es importante destacar que el Pladienolide-B perjudicó de forma similar a las CSC, reduciendo su capacidad de crecimiento y aumentando su sensibilidad a la quimioterapia. El Pladienolide-B también redujo el crecimiento tumoral del xenoinjerto de las líneas modelo de PDAC/CSCs in vivo en el pez cebra y en ratones. Así pues, podemos concluir que, la sobreexpresión de SF3B1 representa una vulnerabilidad terapéutica en el PDAC que permite dirigir el splicing con Pladienolide-B no sólo en las células cancerosas sino también en las CSCs.
3. Conclusión En conjunto, los estudios desarrollados en la presente Tesis aportan nuevas pruebas para avanzar en el conocimiento molecular del papel de la maquinaria de splicing y sus alteraciones en diferentes cánceres. En particular, identificamos factores de splicing específicos que están alterados en PanNETs, PDAC y PCa, y que parecen desempeñar un papel funcional relevante en estos tumores, donde podrían servir como herramientas útiles para el desarrollo de nuevos biomarcadores y podrían ser la diana de nuevos fármacos dirigidos al splicing, como Pladienolide-B y/o sus derivados. Estos hallazgos refuerzan la relevancia de examinar el splicing alternativo, sus elementos y alteraciones para abrir nuevas vías para la medicina de precisión en cánceres sólidos.
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