Caracterización estructural y funcional de la isoenzima glutaminasa GLS2 y su implicación en cáncer

• Autores: María del Carmen Gómez García
• Directores de la Tesis: Javier Márquez Gómez (dir. tes.), Jose Angel Campos Sandoval (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Málaga ( España ) en 2022
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Miguel Ángel Medina Torres (presid.), Isabel Chillón Gázquez (secret.), Azucena Esparís Ogando (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biotecnología Avanzada por la Universidad de Málaga
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Biología molecular
      • Proteínas
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: RIUMA
• Resumen

  • Las isoenzimas de glutaminasa (GLS y GLS2) catalizan el primer paso de la ruta de la glutaminolisis (conversión de glutamina a glutamato e iones amonio) y desempeñan un papel clave en crecimiento y proliferación del cáncer. GLS y GLS2 tienen diferentes patrones de expresión y regulación en diferentes órganos y tumores. Mientras que GLS se encuentra altamente expresado en muchos tipos de cáncer y se relaciona con proliferación, GLS2 se relaciona con un estado celular quiescente, menos proliferativo y diferenciado. En el primer capítulo de la tesis se ha abordado la caracterización cinética y funcional de la isoenzima GLS2. En la primera parte se describe la expresión y purificación heteróloga de proteínas recombinantes GLS2 (GLS21-602 y GLS256-602) en células procariotas y eucariotas. La purificación se llevó a cabo mediante una doble cromatografía, IMAC-Ni (Immobilized Metal Affinity Chromatography) seguida de una exclusión molecular. Se obtuvo una proteína inestable y con tendencia a la agregación al expresar la proteína truncada en E. coli, mientras que la proteína producida en células de insecto presentó mayor estabilidad. La estabilidad térmica de cada proteína se evaluó mediante ensayos de desplazamiento térmico. Con la proteína producida en células de insecto mediante el sistema MultiBac, se ensayaron casi 4000 condiciones diferentes para conseguir la formación de cristales de proteínas. Se obtuvieron microcristales de la proteína truncada bajo unas condiciones compuestas por Tris-HCl 0.1 M, pH 8 y sulfato de litio 1.6 M. La caracterización cinética de la GLS2 truncada mostró una baja dependencia de fosfato. Con respecto a la glutamina (Gln), la proteína expresada en eucariotas presentó un comportamiento hiperbólico, mientras que el comportamiento fue sigmoidal para la expresada en procariotas. Se midió la afinidad de GLS2 por uno de sus ligandos conocidos, GIP (Glutaminase-Interacting Protein) mediante BLI. Se obtuvo una KD de 77 nM, que indica una interacción fuerte. Mediante un análisis de espectrometría de masas (MS) de GLS2 humana se identificó que estaba hipusinada, modificación postraduccional relevante relacionada con su importe a núcleo y su función. En el segundo capítulo de la tesis se describe un análisis proteómico cuantitativo de líneas de glioblastoma (GBM) humano con expresión regulada de GLS2, además se aportan notables evidencias de una localización nuclear y mayoritariamente mitocondrial de la proteína. Por otro lado, se relacionaron resultados de parada del ciclo celular en G2/M con el aumento en la expresión de proteínas supresoras tumorales. Finalmente, se realizó un análisis bioinformático de los resultados de las proteínas diferencialmente expresadas (DEP) en células de GBM que sobreexpresaban GLS2. Mediante la herramienta STRING se analizó la interacción proteína-proteína y empleando la aplicación ClueGO, dentro de CYTOSCAPE, se realizó un enriquecimiento funcional de las DEP mediante ontología génica (GO) y consultando las bases de datos REACTOME y KEGG. Se obtuvieron términos relacionados con adhesión celular, migración, ciclo celular, degradación de proteínas y glucolisis. Las proteínas de mayor centralidad y con mayor número de conexiones dentro de la red de interacción mostraron un enriquecimiento en términos relacionados con el ciclo celular para las proteínas reprimidas. Para las proteínas sobreexpresadas se obtuvieron mayoritariamente términos relacionados con malignidad y tumorigénesis.