Resumen de Estructura y dinámica de los cromosomas: papel en la plasticidad genómica y patogénica de fusarium oxysporum
1. Introducción o motivación de la tesis Las especies del género Fusarium se encuentran entre los hongos más patógenos y toxicogénicos descritos. La variabilidad genética intra-específica es esencial para la evolución y la adaptación, permitiendo al patógeno adaptar su estilo de vida a la planta hospedadora y a las condiciones ambientales variables. Cada uno de los millones de núcleos que constituyen el micelio de una colonia y sus esporas descendientes, es capaz de generar un organismo completo, pudiendo estar sometidos a fuertes mecanismos de selección que actúan sobre la competitividad y/o cooperación según la necesidad en cada caso.
Se ha observado recientemente que la especie Fusarium oxysporum presenta un elevado grado de inestabilidad genómica que se manifiesta, entre otros, en frecuentes reorganizaciones cromosómicas. El objetivo principal de la Tesis Doctoral ha sido la caracterización y cuantificación de la tasa de reorganización que se produce en este hongo, determinando, además, el efecto de las reorganizaciones en su desarrollo y patogénesis. Una vez puesta a punto la metodología, se podrá determinar la tasa de reorganización no solo en la estirpe silvestre (“wild type”) sino también en mutantes definidos, que están afectados en distintas funciones del mantenimiento cromosómico. El conocimiento de la dinámica de estos cromosomas accesorios permitirá dilucidar los mecanismos de adaptación que el patógeno desarrolla bajo determinadas condiciones. Para abordar este objetivo general se han definido los siguientes objetivos específicos:
1) Evaluación de los factores ambientales, tales como el contenido en nitrógeno del medio de cultivo, sobre la generación de variantes espontáneas en el crecimiento colonial de Fol4287, como indicador de la plasticidad del genoma.
2) Caracterización molecular de los extremos cromosómicos, tales como telómeros y subtelómeros para evaluar su contribución a la estabilidad cromosómica. Se han estudiado algunos aspectos específicos, tales como la estructura física de los extremos cromosómicos, la variabilidad de las regiones teloméricas y subteloméricas y la función de los genes localizados en la región subtelomérica en la inestabilidad cromosómica.
3) Dilucidación de la variabilidad genómica a través de los cambios en el número de copias como mecanismo de adaptación mediante el seguimiento de las frecuencias de pérdida y ganancia en distintas condiciones experimentales, mediante el uso de diferentes metodologías experimentales.
4) Identificación de las reorganizaciones cromosómicas implicadas en la plasticidad del genoma de Fol4287.
5) Identificación de los mecanismos implicados en la variación del número de copias y en las reorganizaciones cromosómicas.
2. Contenido de la investigación Las investigaciones llevadas a cabo durante la Tesis Doctoral han hecho uso de diferentes metodologías experimentales basadas en técnicas moleculares para conseguir los objetivos, con la propuesta de diferentes tareas, que han consistido en: o Análisis molecular de las regiones subteloméricas (análisis Southern, CHEF, RT-PCR).
o Sobreexpresión del gen subtelomérico FOXG_15617, mediante clonación de la fase codificante y su fusión a un promotor constitutivo. Caracterización molecular, fenotípica y patotípica de los transformantes portadores de dichas construcciones.
o Clonación del gen FOXG_15617 en S. cerevisiae bajo el control de un promotor inducible. Caracterización molecular y fenotípica de los transformantes obtenidos.
o Obtención de mutantes en genes implicados en mecanismos de reparación de rotura del ADN de doble cadena por recombinación homóloga o por mecanismos no homólogos, así como mutantes en las histona metiltransferasas implicadas en la remodelación de la cromatina.
o Obtención de mutantes en dichos genes sobre un fondo genético portador de un marcador RFLP en una de las dos regiones duplicadas del cromosoma 13 de F. oxysporum.
o Inserción de marcadores fluorescentes en regiones cromosómicas concretas susceptibles de sufrir sucesos de inestabilidad. Detección, mediante citometría de flujo, de la pérdida de dichas regiones, asociada a la pérdida de fluorescencia.
o Confirmación de las reorganizaciones cromosómicas en F. oxysporum mediante electroforesis en campo pulsante.
o Purificación a partir de geles de agarosa de un nuevo mini-cromosoma (13mini) identificado en F. oxysporum y determinación de su secuencia nucleotídica.
o Determinación, mediante PCR cuantitativa, de la tasa de reorganización cromosómica (duplicaciones o pérdidas) en la estirpe silvestre y en los mutantes afectados en funciones de reparación del ADN, tras una evolución experimental. o Determinación, mediante técnica RFLP, de la tasa de pérdida cromosómica en la estirpe silvestre y en distintos mutantes afectados en funciones de reparación de ADN o en metilación de histonas, tras una evolución experimental.
3. Conclusión Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral han contribuido a la generación de nuevos conocimientos sobre la estructura del genoma de F. oxysporum . Se han confirmado algunos eventos de inestabilidad cromosómica previamente descritos para otras especies de hongos patógenos. El estudio de la dinámica cromosómica mediante análisis cariotípico ha demostrado que esta técnica puede proporcionar información complementaria a la secuenciación, especialmente en las regiones ricas en secuencias repetidas, donde los problemas de ensamblaje de secuencias son más pronunciados. Se enuncian a continuación algunas conclusiones específicas: 1) La estructura de las regiones subteloméricas se encuentra altamente conservada en los cromosomas de F. oxysporum, aunque no se ha podido establecer una relación causal entre la estructura de esta región y la inestabilidad cromosómica.
2) Los extremos cromosómicos de F. oxysporum son muy similares a los del patógeno del arroz Magnaporthe oryzae, lo que sugiere que la las regiones conservadas tienen un papel importante en el mantenimiento y la estabilidad de los cromosomas.
3) Las variaciones en el número de copias y reorganizaciones cromosómicas ocurren exclusivamente en las regiones accesorias del genoma y afectan de manera recurrente posiciones específicas en los cromosomas.
4) Las reordenaciones cromosómicas se han detectado con éxito mediante el uso de técnicas moleculares que permiten la identificación de cambios estructurales con sondas específicas de región.
5) Se ha identificado un nuevo mini-cromosoma (Chr 13mini) independiente, que corresponde a una duplicación parcial del extremo derecho del cromosoma 13. La delucidación del mecanismo de duplicación requiere un estudio más profundo.
6) La marca epigenética de la histona H3, H3k9me3, contribuye a la estabilidad del cromosoma accesorio 13mini.
4. Bibliografía Las referencias más relevantes para plantear la hipótesis de partida para el desarrollo de la Tesis Doctoral se enumeran a continuación:
Dunham M, Badrane H, Ferea T, Adams J, Brown P, Rosenzweig F, Botstein D, (2002) Characteristic genome rearrangements in experimental evolution of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences 99(25): 16144-16149 (DOI: 10.1073/pnas.242624799) Kyungjae M, Clark C, Richard K, (2001) Multiple pathways cooperate in the suppression of genome instability in Saccharomyces cerevisiae. Nature 411: 1073–1076 (DOI: 10.1038/35082608) Putnam D, Hayes K, Kolodner D, (2009) A Specific pathways prevent duplication-mediated genome rearrangements. Nature 460: 984–989 (DOI: 10.1038/nature08217) Vlaardingerbroek I, Beerens B, Shahi S and Rep M (2015) Fluorescence assisted selection of transformants (FAST): using flow cytometry to select fungal transformants. Fungal Genetics and Biology 76: 104–109 (DOI: 10.1016/j.fgb.2015.02.003) Las investigaciones realizadas han conducido a dos publicaciones científicas hasta la fecha:
Gómez-Gil L, Camara Almiron J, Rodriguez Carrillo PL et al., (2018) Nitrate assimilation pathway (NAP): role of structural (nit) and transporter (ntr1) genes in Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici growth and pathogenicity. Current Genetics 64:493–507. https://doi.org/10.1007/s00294-017-0766-8 Díaz, CL., Gómez-Gil, L., Pérez Nadales, E., Velasco, GN., Di Pietro, A. (2022). Quantification and Isolation of Spontaneous Colony Growth Variants. Methods in Molecular Biology 2391: 55-62. DOI: 10.1007/978-1-0716-1795-3_5.Contribución a un capítulo de libro donde se describe una nueva metodología desarrollada y aplicada en la tesis doctoral.
Asimismo, se han presentado diversas comunicaciones en congresos nacionales e internacionales:
1.- Díaz, CL., Gómez-Gil, L., Pérez Nadales, E., Velasco, GN., Di Pietro, A. (2022). Quantification and Isolation of Spontaneous Colony Growth Variants. Methods in Molecular Biology 2391: 55-62. DOI: 10.1007/978-1-0716-1795-3_5.
2.- Gómez-Gil, L. (2022). Contribution of chromosome rearrangements to the genome plasticity of the fungal pathogen Fusarium oxysporum. Joint Fungal Genetics Seminars. Talk, online. Universidad de Sevilla y Universidad de Córdoba.
3.- Gómez Gil, L. (2021). Structural dynamics of chromosomes and its role in genome plasticity. Joint Fungal Genetics Seminars. Talk, online. Universidad de Sevilla y Universidad de Córdoba.
4.- Di Pietro, A., López Díaz, C., Ayhan, D., Gómez Gil, L., Ma, L.J. (2021). Estudio de los mecanismos de adaptación en el hongo patógeno Fusarium oxysporum mediante evolución experimental. XXVIII Congreso de la Sociedad Española de Microbiología (Nacional). Comunicación oral. Online.
5.- Gómez Gil, L., López Díaz, C., Ayhan, D., Ma, L.J., Di Pietro, A. (2021). Contribution of chromosome rearrangements to the genomic plasticity of the fungal pathogen Fusarium oxysporum. XLII Congreso de la Sociedad Española de Genética (Nacional). Flash Talk. Online.
6.- Di Pietro, A., López Díaz, C., Ayhan, D., Gómez Gil, L., Okeke, I., Sohrab V., Ma, L.J. (2020). Transposons drive adaptive evolution in the fungal pathogen Fusarium oxysporum. EMBO, EMBL Symposium: Molecular Mechanisms in Evolution and Ecology (Internacional). Póster. Heidelberg 7.- Gómez Gil, L., López Díaz, C., Ayhan, D., Ma, L.J., Di Pietro, A. (2020). Structural dynamics of chromosomes and its role in genome plasticity of Fusarium oxysporum. 15th European Conference on Fungal Genetics (Internacional). Póster. Roma 8.- Gómez Gil, L., Bravo Ruiz, G., Di Pietro, A., Gonzalez Roncero, MI., (2018). Functionality of Fusarium oxysporum chromosome subtelomeric regions in genome plasticity. 14th European Conference on Fungal Genetics (Internacional). Póster. Haifa 9.- Gómez Gil, L., Bravo Ruiz, G., Di Pietro, A., Gonzalez Roncero, MI., (2017). Physical structure of the chromosome ends and their implications in Fusarium oxysporum genome plasticity. 15th Congress of the Mediterranean Phytopathological Union (Internacional). Póster. Córdoba.
