Multifunctional analysis of new Bacillus thuringiensis strains and their potential as pest control agents

• Autores: Argine Unzué Pozas
• Directores de la Tesis: Primitivo Caballero (dir. tes.), Carlos Caballero Sánchez (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Pública de Navarra ( España ) en 2023
• Idioma: inglés
• Número de páginas: 228
• Títulos paralelos:
  • Análisis multifuncional de nuevas cepas de Bacillus thuringiensis y su potencial como agentes de control de plagas
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Academica-e
• Resumen
  • español

    El uso de plaguicidas químicos ha sido la práctica más extendida para el control de plagas en agricultura en los últimos 80 años. Sin embargo, estos tipos de insecticidas han experimentado fuertes medidas regulatorias que limitan su uso debido a su falta de bioseguridad. Por lo tanto, nunca ha sido mayor la necesidad de alternativas seguras, sostenibles y respetuosos con el medio ambiente. Bioinsecticidas, y más específicamente, soluciones basadas en Bacillus thuringiensis (Bt) han conseguido popularidad en los programas de Manejo Integrado de Plagas (MIP) debido a sus propiedades biocidas, adaptabilidad, y sobre todo seguridad. Bt es una bacteria Gram-positiva que forma espora de Resistencia durante la fase estacionaria de crecimiento y un cristal parasporal compuesto de d-endotoxinas (entre otras, proteínas Cry y Cyt) con actividad insecticida. Bt es el agente entomopatógeno más empleado comúnmente para control de plagas en campo y su uso es compatible con otros métodos de control. El principal propósito de esta tesis era el estudio de diversidad de cepas y el potencial pesticida de cepas de Bt de tres colecciones. Cada colección comprendía cepas aisladas de un hábitat específico, siendo granjas avícolas localizadas en el sur de los Pirineos, dehesas de Extremadura y áreas no cultivadas de diversas regiones del mundo. Se aislaron un total de 294 cepas y agrupadas en 44 grupos o perfiles basados en su contenido de genes plaguicidas. Los tres hábitats mostraron una diversidad de genes plaguicidas moderado y no se encontró una correlación directa entre genes específicos y hábitat. Sin embargo, algunos genes fueron más frecuentes en ciertos ambientes. Por ejemplo, a pesar de que los genes cry1, cry2, y cry9 estaban presentes en los tres hábitats, cry1 y cry2 eran relativamente más abundantes en áreas no cultivadas. El potencial de propiedades pesticidas de los 44 diferentes perfiles fueron caracterizados in silico basado en la bibliografía disponible y se encontró que los perfiles más frecuentes pertenecían a cepas con el potencial de controlar especies de lepidópteros (conteniendo genes cry1, cry2 y cry9) para todos los hábitats estudiados. Estos fueron seguidos por potenciales cepas nematicidas (con genes parecidos a cry5 y app6), que fueron también identificados en todos los hábitats estudiados. Cepas con hipotética actividad contra coleópteros (genes cry3 y genes cry8 y similares) y dípteros (cry4, cry10, cry11 y cyt) fueron encontrados solamente en granjas y dehesas. La caracterización in silico fue posteriormente verificada in vivo, probando a una única concentración (10 µg/ml) de esporas y cristales de cada perfil contra especies representativas de órdenes de insectos de lepidópteros (Spodoptera littoralis y Helicoverpa armigera), dípteros (Aedes albopictus) y coleópteros (Leptinotarsa decemlineata). De modo interesante, algunos de los perfiles de lepidópteros activos identificados en este estudio contenían combinaciones de genes diferentes (cry1C, cry1D, cry1E, cry2A, xpp22-similar) a la mayoría de las cepas encontradas como productos comerciales ampliamente utilizados (DiPel® y Xentari®). Ensayos realizados contra mosquitos y coleópteros también aportaron resultados prometedores de grupos que contenían genes plaguicidas diferentes a los más comúnmente utilizados por soluciones de Bt (p. ej. Vectobac® y Novodor®, respectivamente). Hoy en día, la mayoría de los productos del mercado basados en Bt están destinados al control de plagas de lepidópteros, coleópteros y dípteros. Sin embargo, otras plagas de gran importancia en agricultura quedan a menudo fuera del alcance de dichas soluciones. Algunos ejemplos de esto son ácaros, nematodos y hongos. Uno de los objetivos de esta tesis fue abordar las propiedades multifuncionales de una cepa de Bt (de las colecciones construidas) con el potencial de controlar varias plagas, incluidas aquellas para las que las soluciones de Bt actuales no ofrecen cobertura. Teniendo esto en cuenta, se seleccionó la cepa candidata BST-122, que presentaba un interesante contenido génico plaguicida. Para evaluar el potencial multifuncional de BST-122, se realizaron bioensayos contra el escarabajo de la patata (L. decemlineata), para el cual las esporas y cristales produjeron una mortalidad significativa. Además, una proteína similar a Cry5 producida por la cepa resultó tóxica contra el complejo ácaro fitófago Tetranychus urticae cuando se administró en altas concentraciones. Cuando se evaluó contra los nematodos fitoparásitos Meloidogyne incognita en ensayos en planta, los factores secretados de la cepa produjeron una reducción significante de las agallas en las raíces de las plantas de pepino. Finalmente, BST-122 produjo una considerable deceleración del crecimiento en dos serovares diferentes de Fusarium oxysporum (lycopersici y meloni) y Verticillium dahliae en condiciones in vitro. En definitiva, esta tesis proporciona información sobre la diversidad de cepas silvestres de Bt que pertenecen a diferentes hábitats y su potencial para controlar diferentes organismos plaga. Además, se muestran las propiedades multifuncionales de una cepa Bt, enfatizando la importancia de nuevas proteínas y factores secretados para expandir el uso de soluciones de Bt más allá de los confinamientos de los órdenes de insectos de lepidópteros, coleópteros y dípteros e incluir otros organismos plaga de importancia económica.

  • English

    The use of chemical pesticides has been the most extended practice for the control of pests in agriculture for the past 80 years. However, these types of insecticides have experienced strong regulatory measures that limit their use due to their lack of biosecurity. Therefore, the need for safer, sustainable, and environmentally friendly alternatives has never been greater. Bioinsecticides, and more specifically, Bacillus thuringiensis (Bt) based solutions have gained popularity in Integrated Pest Management (IPM) programs due to its biocidal properties, scalability, and overall safety. Bt is a Gram-positive bacterium that forms a resistance spore during the stationary phase of growth and a parasporal crystal which is comprised of d-endotoxins (among others, Cry, and Cyt proteins) with insecticidal activity. Bt is the most commonly applied entomopathogenic agent for pest control in the field and its use is compatible with other control methods. The main aim of this thesis was the study of the strain diversity and pesticidal potential of strains from three Bt libraries. Each of the libraries comprised strains collected from a specific habitat, namely, poultry farms located in the south of the Pyrenees, the meadows of Extremadura, and non-cultivated areas from diverse regions of the world. A total of 294 strains were isolated and clustered into 44 groups or profiles based on their pesticidal gene content. All three habitats showed a moderate pesticidal gene diversity and no direct correlation between specific genes and habitats was found. However some genes were more frequent in certain environments. For instance, although cry1, cry2, and cry9 genes were present in all three habitats, cry1 and cry2 were more relatively abundant in non-cultivated areas. The potential pesticidal properties of the 44 different profiles were characterized in silico based on the available literature and found that the most frequent profiles belonged to strains with the potential to control lepidopteran species (harboring cry1, cry2, and cry9 genes) for all the studied habitats. These were followed by potential nematocidal strains (carrying cry5-like and app6-like genes), which were also identified in all the studied habitats. Strains with hypothetical activity against coleopterans (cry3 and cry8 and similar genes) and dipterans (cry4, cry10, cry11, and cyt) were only found in farms and meadows. The in silico characterization was then verified in vivo, by testing a single concentration (10 µg/ml) of spores and crystals of each profile against representative species of the lepidopteran (Spodoptera littoralis and Helicoverpa armigera), dipteran (Aedes albopictus), and coleopteran (Leptinotarsa decemlineata) insect orders. Interestingly, some of the lepidopteran active profiles identified in this study harbored different gene combinations (cry1C, cry1D, cry1E, cry2A, xpp22-like) to those found in the Bt strains of the most widely used commercial products (DiPel® and Xentari®). Bioassays performed against mosquitoes and coleopterans also provided promising results for groups harboring pesticidal genes that were different from those found in the most commonly used Bt solutions (Eg. Vectobac® and Novodor®, respectively). Today, most Bt-based market products are targeted towards the control of the lepidopteran, coleopteran, and dipteran pests. However, other pests of major importance in agriculture are often out of the scope of said solutions. Some examples of this are mites, nematodes and fungi. One of the objectives of this thesis was to address the multifunctional properties of a Bt strain (from the constructed Bt libraries) with the potential to control several pests, including those for which the current Bt solutions offer no coverage. With this in mind, candidate strain BST-122, which presented an interesting pesticidal gene content, was selected. To evaluate the multifunctional potential of BST-122 bioassays were performed against the Colorado potato beetle (L. decemlineata), for which the spores and crystals produced significant mortality. Furthermore, a Cry5-like protein produced by the strain proved toxic against the challenging phytophagous mite Tetranychus urticae when administered in high concentrations. This result could serve as a basis for searching for new Cry5-like proteins with improved activity against mites. When evaluated against the phytoparasitic nematodes Meloidogyne incognita in plant assays, secreted factors of the strain produced a significant reduction of galls in the roots of cucumber plants. Finally, BST-122 produced a considerable growth deceleration in two different serovars of Fusarium oxysporum (lycopersici and meloni) and Verticillium dahliae in vitro. All in all, this thesis provides insights on the diversity of wild-type Bt strains belonging to different habitats and their potential to control different pest organisms. Additionally, the multifunctional properties of a Bt strain are shown, emphasizing the importance of new proteins and secreted factors to expand the use of Bt solutions beyond the confinements of the Lepidopteran, Coleopteran and Dipteran insect orders and include other pest organisms of economic importance.