Paper biosensors for the rapid diagnosis of infections and sepsis using plasmonic nanoparticles

• Autores: Francy Alejandra Alba Patiño
• Directores de la Tesis: Roberto de La Rica Quesada (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de les Illes Balears ( España ) en 2022
• Idioma: inglés
• Tribunal Calificador de la Tesis: Cesar Fernandez Sanchez (presid.), Edwin Palacio Barco (secret.), Begoña Espiña Barbeitos (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Ciencia y Tecnología Química por la Universidad de las Illes Balears
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Biosíntesis
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: RepositoriUIB
• Resumen
  • español

    Los biosensores colorimétricos de papel basados en nanotecnología son adecuados para realizar mediciones en el punto de atención, ya que el papel es flexible, absorbente, económico, liviano y se puede desechar fácilmente. Las nanopartículas de oro (AuNPs) son el material generalmente empleado para producir las señales colorimétricas observadas en estos sensores. Esto es debido a que exhiben colores intensos ya que presentan un alto coeficiente de extinción molar. Una limitación en el uso de AuNPs es la dificultad para lograr la amplificación de la señal, ya que la señal depende únicamente del coeficiente de extinción de las nanopartículas y del número de interacciones específicas con el analito objetivo. Otra limitación, es que, una vez secas, las nanopartículas tienden a adsorberse de forma irreversible a los sustratos de papel, lo que dificulta su almacenamiento en este material.

    En esta tesis doctoral se desarrolló una nueva y versátil tecnología que permite superar las limitaciones de los biosensores de papel tradicionales. Para lograrlo, primero se optimizaron algunos aspectos claves de la fabricación, esto incluyó la ejecución de tres métodos de síntesis de AuNPs, tales como la reducción de iones de oro con citrato, poli(clorhidrato de alilamina) PAH o polivinilpirrolidona (PVP). Luego, las AuNPs se cubrieron con grupos carboxilo, amino, o polivinilpirrolidona (PVP), respectivamente, para posteriormente ser modificadas con proteínas a través de 3 vías. Las mejores condiciones obtenidas de los experimentos anteriores se aplicaron para la detección en PBS del biomarcador de sepsis interleuquina 6 (IL-6), obteniendo un límite de detección (LOD) de 0,1 pg·mL-1.

    En segundo lugar, se desarrolló un inmunosensor ultrarrápido fabricado completamente en papel. Este dispositivo implementa un nuevo diseño basado en reservorios que almacenan AuNPs decoradas con anticuerpos en papel de filtro. Esto se logró modificando el papel de filtro con el polímero de carga negativa poliestireno sulfonato (PSS). Las nanopartículas en el reservorio se pueden transferir con gran eficacia a un papel húmedo receptor que contiene el analito. Una vez transferidas, las AuNPs mantienen su color y su función de biorreconocimiento. Para probar este método, se integró este reservorio en biosensores de papel para la detección de la glicoproteína B del citomegalovirus humano añadido a muestras de suero.

    Posteriormente, utilizando el mismo diseño, se detectó el patógeno Pseudomonas aeruginosa (PA), en solo 8 min con un límite de detección en PBS de 105 células·mL−1, que es el valor umbral clínico para diagnosticar una infección. Como resultado, fue posible diferenciar las muestras positivas para PA de las muestras negativas, de las muestras con flora mixta e incluso de las muestras positivas para otros patógenos productores de catalasa.

    Finalmente, el implementar el nuevo diseño con el reservorio, permitió mejorar los resultados obtenidos con los primeros biosensores que detectaban IL-6. En primer lugar, el tiempo de ensayo se redujo por debajo de los 10 min y, en segundo lugar, el LOD disminuyó hasta 10−3 pg·mL-1. Adicionalmente, se adquirieron medidas semicuantitativas en un amplio rango dinámico entre 10−3 y 102 pg·mL-1 en PBS. Debido al LOD tan bajo de este inmunosensor, las muestras de sangre y BAS de pacientes con COVID-19 se pudieron diluir entre 100 y 1000 veces para minimizar las interferencias de la matriz. Con los resultados obtenidos, los pacientes fueron estratificados según la gravedad.

    Las señales colorimétricas de los biosensores se pueden ver y analizar a simple vista, fotografiando el papel o con una aplicación móvil de densitometría desarrollada en nuestro laboratorio (convirtiendo a nuestros biosensores en una herramienta semicuantitativa). Los biosensores desarrollados son una plataforma analítica completa, muy adecuada para mediciones varios entornos de atención médica y útil para la identificación de posibles casos de sepsis.

  • català

    Els biosensors colorimètrics de paper basats en nanotecnologia són adequats per realitzar mesures al punt d'atenció, ja que el paper és flexible, absorbent, econòmic, lleuger i es pot rebutjar fàcilment mitjançant incineració. Les nanopartícules d'or (AuNPs) són el material generalment emprat per produir els senyals colorimètrics observats en aquests sensors. Això és perquè exhibeixen colors intensos i que presenten un alt coeficient d'extinció molar. Aquests senyals es poden detectar a simple vista o mitjançant un lector especialitzat. A més, en aplicacions recents s’han utilitzat càmeres de telèfons mòbils per capturar els senyals, eliminant la necessitat de comprar instruments addicionals. Encara que les AuNPs són ideals per a biosensors de paper, una limitació del seu ús és la dificultat per aconseguir l'amplificació del senyal, ja que el senyal depèn únicament del coeficient d'extinció de les nanopartícules i del nombre d'interaccions específiques amb l'analit objectiu. Una altra limitació és que, un cop seques, les nanopartícules tendeixen a adsorbir-se de forma irreversible als substrats de paper, cosa que dificulta el seu emmagatzematge en reservoris fabricats amb aquest material. Una estratègia plantejada per superar aquest problema ha estat la integració en la fabricació d'altres materials diferents del paper, com ara la fibra de vidre, que és comunament utilitzada en els sensors de flux lateral (LFTs per les sigles en anglès). De fet, la majoria dels LFTs estan compostos per 3 materials diferents: la cel·lulosa, la nitrocel·lulosa i la fibra de vidre. Malauradament, la incorporació de diversos materials en un mateix dispositiu no és totalment compatible amb els dissenys tipus origami, dispositius analítics fets a partir d’una sola peça de paper doblegat. El fet de ser completament de paper en simplifica la fabricació i es permet que totes les seves parts estiguin fàcilment en contacte, evitant l'ús d'adhesius addicionals.

    En aquesta tesi doctoral es va desenvolupar una tecnologia nova i versàtil que permet superar les limitacions dels biosensors de paper tradicionals. Aquesta tecnologia versàtil es pot utilitzar per a la detecció ràpida tant de patògens com de proteïnes marcadores de sèpsia, en matrius reals com sèrum, sang, esput i aspirat bronquial (BAS per les sigles en anglès). És important diagnosticar ràpidament les malalties infeccioses, ja que els organismes que les causen es poden propagar fàcilment entre la població a través de l'aire, aliments, aigua o fluids corporals contaminats. A més, les infeccions no tractades poden progressar a sèpsia, una resposta exagerada del sistema immunològic davant d'una infecció que pot provocar una fallada multisistèmica que pot matar el pacient en poques hores. 24 Per tal d'adaptar els biosensors de paper per a la detecció de patògens i biomarcadors proteics, es van fer els passos següents. En primer lloc, es van optimitzar alguns aspectes claus de la fabricació del biosensor per reduir el temps d'assaig sense perdre sensibilitat. Això va incloure la implementació de tres mètodes de síntesi d'AuNPs, com ara la reducció d'ions d'or amb citrat, poli(clorhidrat d'alilamina) PAH o polivinilpirrolidona (PVP). Després, les AuNPs es van cobrir amb grups carboxil, amino, o polivinilpirrolidona (PVP), respectivament, per dur a terme tres rutes diferents de bioconjugació per a la unió de proteïnes a la superfície de les nanopartícules. Així mateix, es va estudiar l'ús de capes alternes de polielectròlits per millorar la unió de l'anticòs de captura al substrat de paper. Les millors condicions obtingudes dels experiments anteriors es van aplicar per a la detecció a PBS del biomarcador de sèpsia interleucna 6 (IL-6) obtenint un límit de detecció de 0,1 pg·mL-1. Després, fent servir el mateix sensor, va ser possible detectar un augment d'IL-6 de només 12,5 pg·mL-1 sobre els nivells basals amb un 99% de confiança i utilitzant com a matriu biològica una mostra de sang total d'un donant sa. L'assaig es va completar en 17 min.

    En segon lloc, es va desenvolupar un immunosensor ultraràpid fabricat completament en paper. Aquest dispositiu implementa un nou disseny basat en reservoris que emmagatzemen nanopartícules decorades amb anticossos en paper de filtre. Això es va aconseguir modificant el paper de filtre amb el polímer de càrrega negativa poliestirè sulfonat (PSS). Un cop el polímer sobre el paper s’ha assecat, se li afegeix una gota d'AuNPs i es deixa assecar. Les nanopartícules al reservori es poden transferir amb gran eficàcia a un paper humit receptor que conté l'analit. Un cop transferides, les AuNPs mantenen el seu color i la seva funció de bioreconeixement. Per provar aquest mètode, es va integrar aquest reservori en biosensors de paper per a la detecció de la glicoproteïna B del citomegalovirus humà afegit a mostres de sèrum. S'obtingué un límit baix de detecció de 0,03 ng·mL-1 amb un temps total d'assaig de només 12 minuts.

    Posteriorment, utilitzant el mateix disseny, es va detectar el patogen Pseudomonas aeruginosa (PA), en només 8 min amb un límit de detecció en PBS de 105 cèl·lules·mL−1, que és el valor llindar clínic per diagnosticar una infecció. Per poder detectar aquest bacteri en mostres d'esput, va caldre introduir un nou mètode que liqüés les mostres, ja que el seu alt contingut de mucines les fa molt viscoses i denses i, per tant, difícils de manipular. Aquest mètode es basava en l'ús de la catalasa endògena de les mostres respiratòries (principalment produïda per bacteris catalasa positius a la mostra) per liquar mostres 25 d'esput. Les mostres liquades es van analitzar amb l'immunosensor de paper. Com a resultat, va ser possible diferenciar les mostres positives en PA de les mostres negatives, de mostres amb flora mixta i fins i tot de les mostres positives per a altres patògens productors de catalasa.

    Implementar el nou disseny amb el reservori va permetre millorar els resultats obtinguts amb els primers biosensors que detectaven IL-6. En primer lloc, el temps d'assaig es va reduir per sota dels 10 min i, en segon lloc, el límit de detecció (LOD) va disminuir fins a 10−3 pg·mL-1. Addicionalment, es van adquirir mesures semiquantitatives en unrang dinàmic entre 10−3 i 102 pg·mL-1 quan la IL-6 estava resuspesa en PBS. A causa del LOD tan baix d'aquest immunosensor, les mostres de sang a les quals se'ls va afegir IL-6 es van poder diluir 1000 vegades i així minimitzar les interferències de la matriu, sense afectar la mesura. D'altra banda, es va afegir IL-6 a mostres de BAS prèviament liquat que després es van diluir 10 vegades abans de ser analitzades. En aquest cas la dilució també va reduir les interferències sense afectar al valor de la mesura. Veient que era possible la detecció en mostres complexes, es va seguir el mateix protocol per detectar IL-6 en mostres de sang i BAS de pacients amb COVID-19. Amb els resultats obtinguts, els pacients van ser estratificats segons la gravetat. És important destacar que la capacitat d'aquests biosensors per detectar citocines en sang i mostres respiratòries obre el camí per monitoritzar simultàniament i ràpidament la inflamació local als pulmons i els nivells d'inflamació sistèmica al cos.

    Els senyals colorimètrics obtinguts en aquestes quatre aplicacions es van amplificar fent l'assaig en una tira de paper doblegada. Tota l’estratègia d’amplificació del senyal es descriu en un treball anterior del nostre laboratori. D'altra banda, els senyals colorimètrics dels biosensors es poden veure i analitzar a simple vista, fotografiant el paper o amb una aplicació mòbil de densitometria desenvolupada al nostre laboratori. Això converteix els biosensors proposats aquí en una eina semiquantitativa. A més, la suma de l’alta sensibilitat, el ràpid temps de resposta i la implementació de l’aplicació mòbil de densitometria fan dels nostres biosensors una plataforma analítica completa, molt adequada per fer mesures en diversos entorns d'atenció mèdica i útil per a la identificació de possibles casos de sèpsia.

  • English

    Nanotechnology-based colorimetric paper biosensors are suitable for point-of-care measurements, as paper is flexible, absorbent, inexpensive, lightweight, and can be easily disposed of. Gold nanoparticles (AuNPs) are the material generally used to produce the colorimetric signals observed in these sensors. This is because they exhibit intense colors and have a high molar extinction coefficient. A limitation in the use of AuNPs is the difficulty in achieving signal amplification, since the signal depends only on the extinction coefficient of the nanoparticles and the number of specific interactions with the target analyte. Another limitation is that, once dry, the nanoparticles tend to irreversibly adsorb to paper substrates, which makes it difficult to store them in this material.

    In this doctoral thesis, a new and versatile technology was developed that allows overcoming the limitations of traditional paper biosensors. To achieve this, some key aspects of the fabrication were first optimized, this included the execution of three methods of synthesis of AuNPs, such as the reduction of gold ions with citrate, poly(allylamine hydrochloride) PAH or polyvinylpyrrolidone (PVP). The AuNPs were then capped with carboxyl, amino, or polyvinylpyrrolidone (PVP) groups, respectively, to be subsequently protein-modified through 3 pathways. The best conditions obtained from the previous experiments were applied for the detection in PBS of the sepsis biomarker interleukin 6 (IL-6), obtaining a limit of detection (LOD) of 0.1 pg·mL-1.

    Second, an ultrafast immunosensor made entirely of paper was developed. This device implements a new design based on reservoirs that store antibody-decorated AuNPs on filter paper. This was achieved by modifying the filter paper with the negatively charged polymer polystyrene sulfonate (PSS). The nanoparticles in the reservoir can be transferred with high efficiency to a wet receptor paper containing the analyte. Once transferred, the AuNPs maintain their color and biorecognition function. To test this method, this reservoir was integrated into paper biosensors for the detection of human cytomegalovirus glycoprotein B added to serum samples.

    Subsequently, using the same design, the pathogen Pseudomonas aeruginosa (PA) was detected in only 8 min with a detection limit in PBS of 105 cells·mL−1, which is the clinical threshold value for diagnosing an infection. As a result, it was possible to differentiate PA-positive samples from negative samples, from samples with mixed flora, and even from samples positive for other catalase-producing pathogens.

    Finally, implementing the new design with the reservoir made it possible to improve the results obtained with the first biosensors that detected IL-6. First, the assay time was reduced below 10 min, and second, the LOD decreased to 10−3 pg mL-1. Additionally, semiquantitative measurements were acquired in a wide dynamic range between 10−3 and 102 pg·mL-1 in PBS. Due to the very low LOD of this immunosensor, blood and BAS samples from COVID-19 patients could be diluted 100- to 1000-fold to minimize matrix interferences. With the results obtained, the patients were stratified according to severity.

    The colorimetric signals of the biosensors can be seen and analyzed with the naked eye, by photographing the paper or with a mobile densitometry application developed in our laboratory (turning our biosensors into a semi-quantitative tool). The developed biosensors are a complete analytical platform, very suitable for measurements in various healthcare settings and useful for the identification of possible cases of sepsis.