Características moleculares y funcionales de los receptores solubles del TNF con capacidad anti-quimioquinas de poxvirus
- Autores: Jesús Sergio Martín Pontejo
- Directores de la Tesis: Begoña Ruiz (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2012
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Mariano Esteban Rodríguez (presid.), Núria Gironés Pujol (secret.), Daved Fremont (voc.), José Mario Mellado García (voc.), Amanda Proudfoot (voc.)
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- Tesis en acceso abierto en: digitool-uam.greendata.es
- Resumen
Cytokines are important inducers and regulators of the anti-viral immune response. Tumour necrosis factor ¿ (TNF¿) and chemokines (CKs) are expressed shortly after a viral infection to regulate the effector functions and recruitment of the immune cells that can limit viral spread. Nevertheless, during millions of years of interaction with their hosts, poxviruses have designed effective mechanisms to block the activity of these cytokines.
One of these viral strategies is the expression of soluble versions of homologues of cellular TNF¿ receptors (vTNFRs). Four different vTNFRs have been described so far and named cytokine response modifier B (CrmB), CrmC, CrmD and CrmE. The genes of these vTNFRs are encoded differentially among the species of poxviruses. For instance, Cowpox virus (CPXV), a virus with a broad host range, can express all these vTNFRs, whereas other host-restricted poxviruses, such as Variola virus (VARV), the causative agent of smallpox in humans, or Ectromelia virus (ECTV), that causes a smallpox-like disease in mice (mousepox), uniquely encode for CrmB and CrmD, respectively. We have identified some differences in ligand affinity and specificity among several vTNFRs that might explain the differences of the expression profile of these anti¿TNF¿ proteinsin poxvirus species.
Unlike CrmC and CrmE, CrmB and CrmD possess an extended C-terminal domain that blocks CK activity in vitro. This domain was named SECRET for smallpox virus encoded chemokine receptor. Therefore, CrmB and CrmD display a dual immunomodulatory function, anti-TNF¿ and anti-CKs. We have determined the cytokines belonging to the families of TNF (TNFSFLs) and CKs that are ligands for the CrmD protein from ECTV. We have found that CrmD is not only able to interact with TNF¿ but also binds LT¿, LTß, APRIL and LIGHT with high affinity. In addition, the minimum sizes of this protein required for the activity of the anti-TNFSFLs and SECRET domains have been determined. Surprisingly, the anti-TNF¿ domain of CrmD consists of only three cysteine rich domains (CRDs) and not four as it was previously described.
The structure of some TNFSFL-TNFR complexes has been described. However, little is known about the Las citoquinas son importantes en la inducción y regulación de la respuesta anti-viral. Tras una infección viral, con el fin de limitar la propagación del virus, el factor de necrosis tumoral ¿ (TNF¿) y las quimioquinas (CKs) son expresados para regular el reclutamiento y las funciones efectoras de las células inmunológicas. Sin embargo, durante años de interacción con sus hospedadores los poxvirus han diseñado mecanismos para la inhibición de estas citoquinas.
La expresión de homólogos solubles de los receptores celulares del TNF¿ (vTNFRs), es una de estas estrategias virales. Hasta la fecha se han descrito cuatro vTNFRs diferentes, el modificador de la respuesta de citoquinas B (CrmB), CrmC, CrmD y CrmE. Las distintas especies de poxvirus expresan de manera diferencial estos vTNFRs. Así, mientras que el virus cowpox (CPXV), con un amplio rango de hospedador, expresa los cuatro vTNFRs, el virus de la viruela (VARV), agente causal de la viruela humana, o el virus ectromelia (ECTV), que sólo infecta ratones, únicamente expresan CrmB y CrmD, respectivamente. Se han encontrado diferencias entre los distintos vTNFRs en la especificidad y afinidad por el ligando que podrían explicar este patrón de expresión en las diferentes especies de poxvirus.
CrmB y CrmD, a diferencia de CrmC y CrmE, contienen un dominio C-terminal que inhibe la actividad in vitro de algunas CKs. Este dominio se denominó SECRET por smallpox virus encoded chemokine receptor. Así, CrmB y CrmD poseen una doble actividad, anti-TNF¿ y anti-CKs. Se han determinado los ligandos para la proteína CrmD de ECTV dentro de las familias del TNF (TNFSFLs) y las CKs. Se encontró, que a parte del TNF¿, CrmD podía interaccionar con alta afinidad con LT¿, LTß, APRIL y LIGHT. Además, se delimitó la longitud mínima activa de ambos dominios de CrmD. Sorprendentemente, el dominio anti-TNFSFLs de CrmD fue activo con sólo tres dominios ricos en cisteínas (CRDs) en lugar de los cuatro previamente descritos.
Algunos complejos TNF-TNFRs han sido descritos estructuralmente. Sin embargo, se conoce muy poco de las bases moleculares de la interacción TNF-vTNFR. Por ello, se decidió realizar un análisis exhaustivo mediante mutagénesis dirigida de CrmD. Algunos mutantes fueron incapaces de interaccionar con TNFSFLs, lo que sugiere que esos residuos podrían jugar un papel importante en la unión de CrmD al ligando. Se obtuvo un interesante mutante con una actividad frente al hLT¿ significativamente mayor que la proteína parental. Este análisis podría aportar información muy valiosa para el diseño de nuevos medicamentos antiTNF¿ utilizados frente algunas enfermedades inflamatorias.
La enfermedad causada por ECTV en ratones susceptibles, mousepox, que implica la infección por vía subcutánea del hospedador natural del virus, es un modelo ampliamente extendido para el estudio de la patogénesis de poxvirus. Mediante este modelo y utilizando ECTV recombinantes para distintas formas de la proteína CrmD, se encontró, que ambos dominios de la proteína, anti-TNFSFLs y SECRET, son fundamentales para la virulencia. Está descrito que la respuesta de las células asesinas naturales (NKs) y de los linfocitos T citotóxicos (CTLs), es esencial en la defensa frente a ECTV de ratones resistentes. Con el fin de entender el mecanismo que subyace en el control de la respuesta anti-viral de CrmD, se estudió el efecto de los distintos ECTV recombinantes generados, sobre la respuesta NK y de CTLs en ratones susceptibles. Se encontró que los ECTV que expresaban un dominio anti-TNFSFLs activo, reducían la activación de las células NKs en los ganglios poplíteos a los dos días postinfección. Sin embargo, sólo el virus parental con una proteína CrmD completa, superó la respuesta de CTLs que se da una semana después de la infección en el bazo. Esto sugiere que el dominio SECRET podría tener un papel importante en la modulación de la respuesta adaptativa.
ECTV, además del dominio SECRET, expresa otras proteínas con capacidad anti-CK (vCKBPs) como 35K o A41. Sin embargo, estas vCKBPs adicionales no compensan la ausencia del dominio SECRET. Se descubrió que mediante el dominio SECRET, CrmD podía interaccionar con glicosaminoglicanos (GAGs) de superficie con alta afinidad. Esta propiedad podría permitir a CrmD retenerse y concentrarse en la membranas celulares entorno a los TNFRs celulares y así, desarrollar su actividad anti-TNFSFLs de manera más eficiente.
ABSTRACT molecular basis of TNFSFL-vTNFR interaction. In order to better understand how these viral proteins can efficiently block TNFSFL functions, a wide collection of CrmD mutants was generated. Some mutations abolished CrmD interaction with TNFSFL, suggesting important implications for these mutated residues in TNF binding. Interestingly, one mutant significantly improved the ability of CrmD to block human LT¿.
This molecular study could provide some relevant data for the design of new and more efficient anti-TNF¿ drugs used for the treatment of inflammatory disorders.
Mousepox, caused by ECTV in susceptible mice, is a well-established model for the study of poxvirus pathogenesis that involves the footpad infection of the natural host of the virus. Using different recombinant ECTVs, with CrmD deleted or encoding only one of the two domains of the protein, we have determined that both, the anti-TNFSFL and SECRET domains are essential for virulence. Natural killer cell (NKs) and cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses are known to be important for the defense against ECTV in resistant mice. In order to understand the mechanism used by CrmD to impair the anti-viral response, we have determined the effect of our different CrmD recombinant ECTVs on NK and CTL responses of susceptible mice. Interestingly, ECTVs encoding an active anti-TNF domain of CrmD were able to control the NK cells activation in the popliteal lymph nodes two days after infection. However, only wild type ECTV, that expresses a full lenght CrmD, impaired the CTL response in the spleen a week post-infection, suggesting an important role of the SECRET domain in modulating the adaptive immune response of the host.
In addition to the SECRET domain of CrmD, ECTV encodes for other CK binding proteins (vCKBPs) such as vCCI or A41. However, the absence of the SECRET domain seems not to be replaced by those vCKBPs.
We have found that the SECRET domain also allows CrmD to bind to glycosaminoglycans (GAGs) expressed on the cell surface. The interaction CrmD-GAGs could facilitate the retention of this protein in high concentration close to cellular TNFRs and therefore, making the anti-TNF activity of CrmD more efficient.
