Methodological preparation and characterization of the microbial ecology of the skin
- Autores: Marc García Garcerà
- Directores de la Tesis: Francesc Calafell Majó (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat Pompeu Fabra ( España ) en 2013
- Idioma: inglés
- Tribunal Calificador de la Tesis: Fernando González Candelas (presid.), Carles Ubeda Morant (secret.), Eduardo P. C. Rocha (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TDX
- Resumen
- español
El estudio de la microbiota de la piel ha sido siempre enfocado hacia un punto de vista clínico. Aún así, una aproximación ecológica a la microbiota cutánea está imposibilitada por múltiples limitaciones metodológicas, entre las que se incluyen la elevada ratio de DNA huésped/DNA comensal o la baja cantidad absoluta de ADN microbiano. En contraste con el próspero campo de la metagenómica intestinal, la metagenómica de la piel ha sido limitada y por eso, en esta tesis nos centramos en sentar las bases metodológicas, para el futuro del estudio del microbioma de la piel, mediante una aproximación sistemática.
La tesis está dividida en 3 partes principales: En una primera parte, se explica a modo de introducción la piel como ecosistema. Se desarrolla y se definen los principales elementos que intervienen en el mantenimiento del equilibrio homeostático del ecosistema, y las posibles alteraciones que pueden afectar tanto a la microbiota como al huésped.
La segunda parte, presenta los cuatro trabajos que incluye la tesis, divididos en cuatro artículos, publicados o pendientes de publicación. En ellos se han aplicado 4 aproximaciones importantes para la mejora y el desarrollo metodológico del estudio metagenómico de la piel: En primer lugar, se ha testado y comparado un método para construir librerías de NGS a partir de trazas de DNA, permitiendo trabajar con muestras de difícil obtención y aplicarles múltiples experimentos funcionales en una misma muestra sin desaprovecharla durante el proceso de secuenciación. En segundo lugar, se ha definido un método para aislar el DNA microbiano de una muestra completa de piel, y su consecuente análisis metagenómico. Hemos validado el protocolo extensamente en piel de ratón. En tercer lugar, hemos analizado la relación entre la diversidad microbiana un fenotipo aislado del huésped. Y finalmente, se ha analizado el espectro fenotípico del huésped, desde un punto de vista sistémico, caracterizando su estado de salud metabólica y su relación con la microbiota.
De estos cuatro trabajos se extrae una mejora sustancial a nivel metodológico y teórico de los conocimientos del ecosistema de la piel, en nuestro caso, adaptados al ratón como modelo animal, los cuales permiten un avance en la aproximación funcional al estudio de la microbiota de la piel.
Finalmente, esta tesis concluye con una discusión general en la que se intentan ligar todos los resultados obtenidos en las cuatro categorías, y se abre un camino al posible trabajo futuro, desde la incorporación de datos temporales, hasta la adaptación de los métodos definidos como los resultados obtenidos en humanos. También se exponen las conclusiones principales, en las que destacan el éxito metodológico del trabajo expuesto y la imposibilidad de asociación de la relación causal (o su ausencia) de la microbiota en casos de alteración fenotípica en la piel.
- English
The study of skin microbiota has always been focused from a clinical point of view. However, an ecological approach to the skin microbiota is impeded by different methodological limitations, including the high host/microbial DNA ratio or the low microbial content. In contrast with the burgeoning field of gut metagenomics, skin metagenomics has been hindered by the absence of an efficient methodology to work with skin microbial DNA. This thesis aims to settle the basis for further human skin microbiome studies from a systems approach. I have set four different important approaches for a ecological and systematic view of skin: 1) I have tested and compared a method to construct NGS libraries from trace amounts of DNA, allowing to work with very rare samples, and performing multiple functional experiments on the same sample; 2) I have defined a method to isolate the microbial DNA from a skin sample, to perform actual metagenomic studies. We have proved the utility of the method by constructing 2 metagenomic libraries from mouse skin biopsies; 3) I have tested the relationship between microbial diversity and unrelated phenotypes in mouse skin samples; 4) I have analyzed the host phenotypical spectra, characterized what it is metabolic health, and assessed the relationship between health and microbiota.
- català
L’estudi de la microbiota de la pell ha estat sempre enfocat cap a un punt de vista clínic. No obstant, una aproximació ecològica a la microbiota cutània és impossibilitada per multiples limitacions metodològiques, que inclouen la baixa ràtio de DNA hospedador/DNA comensal o la baixa quantitat absoluta de DNA microbià. En contrast al pròsper camp de la metagenòmica intestinal, la metagenòmica cutània ha estat obstaculitzada metodològicament, i per això, aquesta tesi intenta sentar les bases per al futur de l’estudi del microbioma cutàni i la aplicació d’una aproximació de sistemes. He aplicat quatre aproximacions importants per a la observació sistemàtica i ecològica de la pell: 1) He testat i comparat un mètode per construir llibreries de NGS a partir de traces de DNA, permetent treballar amb mostres de difícil obtenció i aplicar-hi multiples experiments funcionals a la mateixa mostra, sense haver d’usar tot el material en la seqüenciació; 2) He definit un mètode per a aïllar el DNA microbià d’una mostra de pell completa per tal de dur a terme una anàlisi metagenòmica de la mostra. Hem demostrat la seva utilitat construint dues llibreries independents a partir de pell de ratolí; 3) He analitzat la relació entre la diversitat microbiana i un fenotip aïllat de l’hospedador; 4) He analitzat l’espectre fenotípic de l’hoste des d’un punt de vista sistèmic, he caracteritzat l’estat de salut metabòlica i la seua relació amb la microbiota.
- español
