Strategies to potentiate bactericidal antimicrobial activity based on the suppression of bacterial stress response systems

• Autores: Sara Díaz Díaz
• Directores de la Tesis: Álvaro Pascual (dir. tes.), José Manuel Rodríguez Martínez (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2023
• Idioma: inglés
• Número de páginas: 283
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  • Tesis en acceso abierto en: Idus
• Resumen
  • español

    Uno de los principales problemas para la salud humana es la aparición de resistencias a los antimicrobianos. Desde el descubrimiento de los antimicrobianos han surgido nuevos mecanismos de resistencia. Se están estudiando diversas estrategias para combatirlos, como el desarrollo de nuevos antimicrobianos, el uso de adyuvantes que aumenten la susceptibilidad, las tecnologías de edición del genoma o la terapia con fagos. Sin embargo, los microorganismos pueden evolucionar rápidamente para asegurar su supervivencia, por lo que a menudo surgen nuevos mecanismos de resistencia. Los mecanismos de resistencia en las bacterias suelen expresarse fenotípicamente, aunque esta expresión podría no afectar a toda la población bacteriana por igual. Este fenómeno se conoce como heterorresistencia. La heterorresistencia se define como la presencia de una población heterogénea de bacterias con una o varias subpoblaciones que muestran mayores niveles de resistencia a los antimicrobianos en relación con la población principal. Esto dificulta la clasificación de los aislados clínicos en términos de nivel de resistencia y puede contribuir al fracaso del tratamiento. Por estas razones, se necesitan diferentes estrategias para combatir la resistencia y la heterorresistencia.

    La respuesta SOS es una respuesta celular coordinada al daño genotóxico que puede contribuir a la evolución de la resistencia a los antimicrobianos, ya que durante la respuesta SOS se transcriben genes relacionados con procesos de reparación y recombinación del ADN. Algunos antimicrobianos, como las quinolonas o los βlactámicos, inducen la respuesta SOS. Se ha demostrado que la supresión de la respuesta SOS aumenta la actividad bactericida de antimicrobianos como las quinolonas. Además, los antimicrobianos bactericidas, como las quinolonas, están relacionados con la acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS) en condiciones aeróbicas, induciendo reacciones que pueden contribuir al daño celular. Los microorganismos contienen sistemas de detoxificación capaces de eliminar estas ROS.

    El objetivo de esta tesis fue (i) evaluar el efecto sinérgico de la supresión de la respuesta SOS (mediante la supresión del gen recA) y la sobreproducción de ROS (mediante la supresión de los sistemas de detoxificación o de los sistemas reguladores del estrés) en el aumento de la actividad y letalidad de las fluoroquinolonas; (ii) evaluar la interacción entre la respuesta SOS (procesos de reparación y recombinación del ADN) y los sistemas de detoxificación en la evolución de la resistencia a ciprofloxacino bajo una exposición antimicrobiana gradual o repentina; y (iii) determinar el impacto de la deleción del gen recA (activador de la respuesta SOS y también necesario para la recombinación homóloga en Escherichia coli) en la reversión de la heterorresistencia.

    Para el primer y segundo objetivo, se preparó un conjunto de mutantes en el que se incluyeron mutantes simples con la respuesta SOS suprimida (ΔrecA), los sistemas de detoxificación suprimidos (ΔkatG, ΔkatE, ΔsodA, ΔsodB, ΔahpC) o los sistemas reguladores del estrés suprimidos (ΔoxyR, ΔrpoS), mutantes dobles con ambos sistemas suprimidos (ΔkatG/ΔrecA, ΔkatE/ΔrecA, ΔsodA/ΔrecA, ΔsodB/ΔrecA, ΔahpC/ΔrecA, ΔoxyR/ΔrecA, ΔrpoS/ΔrecA), mutantes dobles con dos sistemas de detoxificación suprimidos (ΔkatG/ΔkatE, ΔsodA/ΔsodB) y mutantes triples (ΔkatG/ΔkatE/ΔrecA) en E.

    coli BW25113. Además, se prepararon mutantes simples (ΔkatG, ΔsodA, ΔrecA) y mutantes dobles (ΔkatG/ΔrecA, ΔsodA/ΔrecA) en E. coli BW15. BW15 es una cepa con mecanismos de resistencia a quinolonas, que presenta cambios aminoacídicos en GyrA (D87G), GyrB (E465D) y ParE (K390N), así como una deleción en el gen marR. Finalmente, para el tercer objetivo, se utilizaron 23 aislados clínicos de origen bacteriémico o urinario de E. coli, entre ellos ocho aislados pertenecientes al clon de alto riesgo ST131.

    Se encontró un efecto de sensibilización sinérgico para ciprofloxacino cuando se suprimió la respuesta SOS (gen recA) y los sistemas de detoxificación o reguladores del estrés. Sin embargo, esto no se reprodujo para todas las fluoroquinolonas.

    Inesperadamente, no se encontró una mayor sensibilización en los mutantes de la cepa BW15. Por otro lado, la supresión del gen recA junto con los sistemas de detoxificación o los sistemas reguladores del estrés impide el crecimiento bacteriano en presencia de concentraciones subletales de ciprofloxacino y conduce a un mayor efecto bactericida en E. coli.

    La supresión de la respuesta SOS, a través de la deleción del gen recA, y de los sistemas de detoxificación, ayuda a reducir la evolución de la resistencia en E. coli tras una exposición repentina a ciprofloxacino. Por otro lado, la supresión de la respuesta SOS ayuda a reducir la evolución de la resistencia tras una exposición gradual a ciprofloxacino. Por el contrario, bajo esta última condición, la supresión de los sistemas de detoxificación, solos o en combinación con la respuesta SOS, podría favorecer la mutagénesis y la evolución de la resistencia a ciprofloxacino.

    En cuanto a la heterorresistencia, los porcentajes de aislados clínicos que expresan heterorresistencia por disco difusión varían entre el 30% y el 100%, dependiendo del antimicrobiano utilizado. La supresión del gen recA produce la reversión de la heterorresistencia para antimicrobianos como las quinolonas y los βlactámicos. Por último, la heterorresistencia se asoció a la amplificación en tándem de genes de resistencia, como el gen qnrA1, o a un aumento del número de copias de plásmidos que portan genes de resistencia, como el gen blaTEM-1B.

  • English

    One of the major threats to human health is the emergence of antimicrobial resistance. Since the discovery of antimicrobials, new mechanisms of resistance have emerged. Various strategies are being studied to combat the emergence of resistance including the development of new antimicrobial, use of adjuvants to enhance susceptibility, genome-editing technologies, and phage therapy. However, since microorganisms can evolve rapidly to ensure their survival, new resistance mechanisms appear frequently. Although resistance mechanisms in bacteria are usually expressed phenotypically, this expression may not affect the whole bacterial population equally.

    This phenomenon is known as heteroresistance. Heteroresistance is defined as the presence of a heterogeneous population of bacteria with one or multiple subpopulations showing higher levels of antimicrobial resistance relative to the main population. This makes it more difficult to categorize clinical isolates according to the level of resistance and can lead to treatment failure. Different strategies are therefore needed to combat resistance and heteroresistance.

    The SOS response is a coordinated cellular response to genotoxic damage that may contribute to the evolution of antimicrobial resistance,since genes related to DNA repair and recombination processes are transcribed during the SOS response. Certain antimicrobials,such as quinolones and β-lactams, induce the SOS response. Suppression of the SOS response has been shown to enhance the bactericidal activity of antimicrobials such as quinolones. Furthermore, bactericidal antimicrobials such as quinolones are also associated with the accumulation of reactive oxygen species (ROS) under aerobic conditions, inducing reactions that can contribute to cellular damage.

    Microorganisms contain detoxification systems able to detoxify ROS.

    The objectives of this thesis were threefold: (i) to evaluate the synergistic effect of suppression of the SOS response (by suppressing the recA gene) and overproduction of ROS (by suppressing detoxification systems or stress regulatory systems) in increasing the activity and lethality of fluoroquinolones; (ii) to evaluate the interplay between the SOS response (DNA repair and recombination processes) and detoxification systems in the evolution of ciprofloxacin resistance under gradual or sudden antimicrobial exposure; and (iii) to determine the impact of deletion of the recA gene (the SOS response activator, also required for homologous recombination in E. coli) on the reversal of heteroresistance.

    For the first and second objectives, a set of E. coli mutants was prepared. In E. coli BW25113, these included single mutants with suppression of the SOS response (ΔrecA), detoxification systems (ΔkatG, ΔkatE, ΔsodA, ΔsodB, ΔahpC) or stress regulatory systems (ΔoxyR, ΔrpoS); double deletion mutants with both recA and a detoxification system suppressed (ΔkatG/ΔrecA, ΔkatE/ΔrecA, ΔsodA/ΔrecA, ΔsodB/ΔrecA, ΔahpC/ΔrecA, ΔoxyR/ΔrecA, ΔrpoS/ΔrecA); double deletion mutants with two detoxification systems suppressed (ΔkatG/ΔkatE, ΔsodA/ΔsodB) and triple deletion mutants (ΔkatG/ΔkatE/ΔrecA).In E. coli BW15, single (ΔkatG, ΔsodA, ΔrecA) and double deletion (ΔkatG/ΔrecA, ΔsodA/ΔrecA) mutants were prepared. The BW15 strain has quinolone resistance mechanisms, carrying amino acid changes in GyrA (D87G), GyrB (E465D), and ParE (K390N), as well as a deletion in the marR gene. For the third objective, 23 clinical isolates of E. coli of bacteraemic or urinary origin were used, among them eight isolates belonging to the high-risk clone ST131.

    A synergistic sensitization effect was found for ciprofloxacin when the SOS response (recA gene) and detoxification or stress regulatory systems were suppressed. However, this effect was not always replicated for other fluoroquinolones. Unexpectedly, no further sensitization was found for BW15 strain mutants. Suppression of the recA gene with detoxification system genes or stress regulatory system genes prevented bacterial growth in the presence of sublethal concentrations of ciprofloxacin and had an enhanced bactericidal effect on E. coli.

    After sudden exposure to ciprofloxacin, suppression of the SOS response, through deletion of the recA gene, and detoxification systems helps to reduce the evolution of resistance in E. coli. After gradual exposure to ciprofloxacin, suppression of the SOS response helps to reduce the evolution of resistance. Under the latter condition, however, suppression of detoxification systems, alone or in combination with the SOS response, may favour mutagenesis and the evolution of resistance to ciprofloxacin.

    In terms of heteroresistance, the percentages of clinical isolates expressing heteroresistance by disk diffusion varied from 30% to 100%, depending on the antimicrobial tested. Deletion of the recA gene resulted in reversal of heteroresistance to antimicrobials such as quinolones and β-lactams. Finally, heteroresistance was associated with tandem amplification of resistance genes, such as qnrA1, or an increase in the copy number of plasmid-borne resistance genes such as blaTEM-1B.