Estudio del efecto celular y metabólico del eje TWEAK/Fn14 en el microambiente del cáncer de próstata

• Autores: Antonio Altuna Coy
• Directores de la Tesis: Xavier Ruiz Plazas (dir. tes.), Matilde Rodríguez Chacón (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat Rovira i Virgili ( España ) en 2022
• Idioma: español
• Número de páginas: 186
• Tribunal Calificador de la Tesis: R. Bosch Princep (presid.), Sara Larriba Bartolomé (secret.), L. Regis (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biomedicina por la Universidad Rovira i Virgili
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
  • Ciencias médicas
    • Cirugía
      • Urología
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: TDX
• Resumen
  • español

    El principal problema en el tratamiento del CaP es la incapacidad de distinguir entre tumores de crecimiento lento y tumores que suponen un riesgo vital para el paciente. La universalización del uso de los niveles de PSA en sangre como prueba de cribado para el diagnóstico de CaP en los años 90 ha permitido una disminución significativa de la mortalidad, pero ha conllevado sobrediagnósticos que comportan sobretratamientos en los pacientes que se verán afectados por efectos secundarios (incontinencia urinaria, disfunción eréctil, síntomas del tracto urinario inferior, problemas digestivos, etc.) sin recibir a cambio un aumento de la supervivencia relacionada con el tratamiento. Por lo tanto, se requieren nuevos biomarcadores de diagnóstico y/o pronóstico más robustos relacionados con procesos patológicos del CaP para identificar tumores agresivos que ponen en riesgo la vida del paciente.

    Diferentes citocinas proinflamatorias, quimiocinas y factores de crecimiento pueden promover la modulación de procesos celulares relacionados con el desarrollo tumoral como la apoptosis, el metabolismo o el ciclo celular, entre otros. Además, pueden desencadenar la secreción de vesículas extracelulares (VEs) involucradas en la tumorogénesis, particularmente exosomas puesto que son las vesículas de mayor contenido (cargo) en ácidos nucleicos en el microambiente tumoral. Unos de los componentes del cargo más estudiados han sido los microRNAS (miRNAS), que constituyen entre el 30% y el 45% de cargo total de ARN encapsulado, siendo las moléculas de ARN de pequeño tamaño más abundantes en las VEs. Los miRNAs son monocatenarios, de una longitud de entre 17 y 25 nucleótidos, que tienen la capacidad de regular negativamente la expresión de genes diana. Además, los miRNAs encapsulados en las VEs (exomiRNAs) son muy estables en los biofluidos celulares lo que los convierte en excelentes biomarcadores de diagnóstico y/o pronóstico en diferentes patologías, incluido el cáncer.

    La transformación maligna de las células requiere adaptaciones metabólicas para satisfacer la energía necesaria para su mayor tasa de proliferación. La desregulación del metabolismo de los lípidos ha sido un sello distintivo del fenotipo maligno en el CaP.

    Tumor Necrosis Factor-Like Weak Inducer of Apoptosis (TWEAK) es una citocina inflamatoria que se localiza en la superficie celular mayoritariamente en macrófagos/monocitos y puede ser liberada a la circulación por un proceso proteolítico (sTWEAK). La presencia de esta citocina en diversos microambientes tumorales puede provocar inflamación y procesos protumorogénicos (migración, proliferación entre otros) mediante la unión a su receptor bona fide, Fibroblast growth factor-inducible 14 (Fn14), formando el eje TWEAK/Fn14. Este eje se ha postulado como biomarcador en diversas patologías, particularmente en aquellas asociadas a inflamación de bajo grado y en las que el metabolismo tiene un papel relevante, como la diabetes tipo 2, diabetes tipo 1, la obesidad o la esteatosis hepática.

    Aunque el papel del eje TWEAK/Fn14 se ha estudiado en algunos tumores, únicamente en cáncer de cabeza y cuello se ha postulado como posible biomarcador de pronóstico y supervivencia. En el contexto del CaP, donde la inflamación es uno de los factores implicados en el desarrollo del tumor, detectamos la presencia de sTWEAK en semen. Observamos niveles reducidos de sTWEAK en este biofluido en pacientes con CaP agresivo respecto pacientes con CaP indolente. Sin embargo, no existen evidencias sobre la relación de los niveles de sTWEAK y la presencia de CaP.

    En el presente trabajo pretendemos estudiar si la citocina TWEAK está relacionada con el desarrollo patológico del CaP y, además, determinar si su presencia en el microambiente tumoral podría inducir la liberación de VEs y si su cargo de exomiRNAs podría ser útil como biomarcadores de pronóstico.

    Llevamos a cabo 2 estudios retrospectivos.

    En el primer estudio, se realizó un estudio de casos-controles. Se cuantificaron los niveles en suero de sTWEAK mediante la técnica de Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) en una cohorte compuesta por 76 pacientes con CaP (sometidos a prostatectomía radical entre 2015 y 2020 en el Hospital Universitario Joan XXIII de Tarragona) y 159 controles sanos (pacientes con niveles de PSA por debajo del promedio para su edad (<1,3 ng/mL entre 60–69 años y <1,7 ng/mL entre 70–79 años). Se determinó el efecto de TWEAK sobre el metabolismo glucídico y lipídico en el microambiente tumoral prostático mediante un estímulo in vitro con 100 ng/ml de sTWEAK sobre las líneas PC-3 y LNCaP, y la línea celular epitelial prostática sana RWPE-1. También se inhibió en la línea PC-3 el receptor Fn14 utilizando inhibidores de ARN específicos. Además, se utilizaron inhibidores de vías activadas por TWEAK tales como Parthenolide (inhibe la vía canónica del factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas (NF-κB)), Amgen16 (que inhibe la vía no canónica del NF-κB), PD184352 (que inhibe la vía de las quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK1/2)) y MK2206 (inhibidor de la vía de la Proteína Quinasa B (AKT)) para averiguar las vías implicadas en la unión TWEAK/Fn14 en el CaP. Se estudió la expresión de genes involucrados en vías metabólicas lipídicas y glucídicas mediante la técnica real time-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR): Los genes estudiados fueron: genes de entrada de glucosa en la célula (Solute Carrier Family 2 Member 1 (SLC2A1) y Solute Carrier Family 2 Member 4 (SLC2A4)), y genes de la fase de preparatoria Hexoquinasa 1 (HK1) y la 6-Fosfofructo-1-quinasa (PFKM)) y la fase de rendimiento de la glucólisis (la Piruvato Quinasa M2 (PKM2), la Piruvato Deshidrogenasa Alfa 1 (PDHA1) y la Piruvato Deshidrogenasa Lipoamida Quinasa Isoenzima 4 (PDK4)). Respecto a la captación y transporte intracelular de lípidos se cuantificaron los siguientes genes: el Cluster de Diferenciación 36 (CD36) y el Fatty Acid Binding Protein 4 (FABP4), genes de de novo lipogénesis (Acetil-Coa Carboxilasa (ACACA), ATP Citrato Liasa (ACLY), Ácido Graso Sintasa (FASN)), genes implicados en la lipólisis (Carnitina Palmitoiltransferasa 1 Alfa (CPT1A) y Triaglicerol Lipasa (PNPLA2)) y dos factores de transcripción estrechamente relacionados con el metabolismo lipídico (Proteína de unión al elemento de respuesta al esterol 1 (SREBP-1)) y el Receptor gamma activado por proliferador de peroxisomas (PPARG). También se evaluó la expresión proteica de algunos de estos genes mediante la técnica del Western Blot. Se estudió además si los cambios en la expresión provocados por el estímulo de sTWEAK, iban asociados a cambios en la captación de lípidos y acumulación de éstos en las células de CaP mediante kits comerciales.

    El segundo estudió se centró en evaluar el efecto de la citocina sTWEAK sobre la liberación de VEs en células de CaP. Para ello, estimulamos con 100 ng/ml de sTWEAK las células de las líneas celulares PC-3 y LNCaP. Se aislaron las VEs, y el cargo de exomiRNAS se cuantificó la expresión de estos miRNAS mediante RT-qPCR utilizando paneles de 752 exomiRNAs relacionados con procesos cancerígenos. Los exomiRNAs candidatos regulados por sTWEAK en las diferentes líneas celulares se validaron en biopsias líquidas de semen y de orina posterior al examen rectal de una cohorte de 97 pacientes. Estos pacientes se clasificaron en 2 grupos, según la agresividad del tumor, siguiendo las directrices de la International Society of Urological Pathology (ISUP): Bajo Riesgo (Grupo I y II) y Alto Riesgo (Grupo III, IV y V). Se cuantificó por la técnica del ELISA los niveles de sTWEAK en semen de estos pacientes. Mediante herramientas estadísticas, se evaluó la utilidad de los exomiRNAS como paneles de pronóstico de la agresividad del CaP junto con los niveles en semen de sTWEAK, los niveles séricos del PSA y la testosterona en suero, la edad y el volumen prostático. Finalmente se establecieron posibles dianas específicas de los exomiR-221-3p mediante diferentes algoritmos: y se validaron dichas dianas en la línea celular PC-3.

    Observamos que niveles reducidos de sTWEAK en suero en pacientes con CaP junto con niveles elevados de PSA, un índice HOMA-IR elevado y niveles disminuidos de HDL, son predictores independientes de CaP.

    Por lo que respecta al metabolismo de la glucosa, hemos observado mediante experimentos in vitro que un estímulo con sTWEAK sobre las líneas celulares prostáticas PC-3, LNCaP no altera la expresión de genes de transportadores de glucosa (SLC2A4 y SLC2A1), pero provoca una disminución significativa de la expresión de genes relacionados con la fase preparatoria del glucólisis (PFKM y HK1).

    En la línea celular PC-3 observamos un aumento de la expresión de genes de la fase de pago de la glucólisis (PKM2 y PDHA1) y una disminución significativa de la expresión del inhibidor de PDHA1, la PDK4. Estos cambios podrían estar asociados a un aumento del flujo del piruvato hacia la formación de Acetil-CoA en la mitocondria. Respecto al metabolismo lipídico, la estimulación con sTWEAK en células de la línea celular PC-3, provocó un aumento significativo de la expresión de genes relacionados con la lipogénesis (ACACA y FASN), lipólisis (CPT1A y PNPLA2), transporte de lípidos (CD36 y FABP4) y factores de transcripción estrechamente relacionados con el metabolismo lipídico (SREBP-1 y PPARG). Además, este aumento de expresión génica fue acompañado por un incremento de la entrada y acumulación de lípidos en las células. El silenciamiento de Fn14 en la línea celular PC-3 mediante inhibidores de ARN, confirmó que los cambios en el metabolismo lipídico observados por la presencia de sTWEAK eran consecuencia de la unión de sTWEAK a su receptor bonafide Fn14, ya que tras la inhibición y posterior estimulo con sTWEAK no se detectaron cambios en la expresión de los genes ACACA, FASN, CPT1A, PNPLA2, FABP4, CD36, SREBP-1 y PPARG, ni tampoco en la expresión proteica de FASN, CPT1A y FABP4.

    Los ensayos con inhibidores específicos (PD184352 y MK2206) de vías de señalización de MAPK (ERK1/2) y de la vía de AKT respectivamente, corroboraron que la fosforilación de ERK1/2 y AKT (ser473) están relacionadas con el metabolismo lipídico en la línea celular PC-3, lo que apunta a ambas vías como posibles dianas terapéuticas para CaP. En el caso del uso del Parthenolide y Amgen16 (inhibidores de la vía de NF-κB de la vía canónica y no canónica respectivamente), no se detectaron cambios en la expresión génica de los genes estudiados, corroborando que ambas vías no están involucradas en la regulación metabólica lipídica de TWEAK en el CaP.

    Investigamos la expresión relativa de exomiRNAs regulados por TWEAK en semen y en orina después del examen rectal digital de pacientes con CaP estratificados según las directrices del ISUP en Alto Riesgo y Bajo Riesgo. Identificamos en e líneas celulares de CaP (que sTWEAK era capaz de regular 14 exomiRNAs (exomiRNA-125b-1-3p, -193b-3p, -221-3p, - 222-3p, -23a-3p, -27a-3p, -29a-3p, -31-5p, -497-5p, -643, -663b, -940, -9-5p y -99a-3p). Estos exomiRNAs fueron validados en biopsias líquidas de 97 pacientes con CaP. De los 14 exomiRNAS, únicamente la expresión de los exomiR-221-3p, -222-3p y -31-5p estaba significativamente elevados en semen de pacientes con CaP de Alto Riesgo al compararlos con los de Bajo Riesgo, mientras que la expresión de los exomiR-193-3p y -423-5p estaban significativamente disminuida en los pacientes de CaP de Alto Riesgo en muestras de orina después del examen rectal. Después de diversas combinaciones el panel compuesto por la expresión del exomiR-221-3p y -222-3p y los niveles de sTWEAK en semen, fue el seleccionado como el más eficaz a la hora de clasificar correctamente al 87,5% de los pacientes con CaP más agresivos, con un área bajo la curva de 0,857, especificidad del 85,7% y sensibilidad del 76,9%. Además, establecimos que sTWEAK era capaz de modular dos de las dianas establecidas para el exomiRNA-221 mediante el uso de diferentes algoritmos el factor de transcripción 12 (TCF12) y Nemo-like Kinase (NLK) en la línea celular PC-3, ambos genes relacionados con la progresión tumoral en el contexto de CaP. En conclusión, nuestros hallazgos ponen de manifiesto que la detección en biopsia líquida de los exomiRNAs regulados por TWEAK, junto con los niveles de sTWEAK en semen, puede mejorar el pronóstico del CaP.

    CONCLUSIONES Los niveles séricos de sTWEAK están disminuidos en los pacientes con CaP respecto a pacientes control y, además, junto con los niveles elevados de PSA, un índice HOMA-IR elevado y niveles disminuidos de HDL pueden ser usados como predictores independientes de CaP.

    La unión de TWEAK a Fn14 activa las vías de señalización de ERK1/2 y AKT (ser473), potenciando el metabolismo lipídico en células de CaP y regulando la expresión génica y proteica de genes clave de la entrada de lípidos en la mitocondria para su posterior oxidación (CPT1A), la movilización celular de lípidos (FABP4) y en la lipogénesis de novo (FASN) entre otros, e induciendo la captación de ácidos grasos y su acumulación.

    La presencia de sTWEAK en el microambiente de CaP induce la secreción de VEs y modifica el cargo de exomiRNAs El panel en semen formado por la expresión relativa del exomiR-221-3p y -222-3p, junto con los niveles de sTWEAK, es capaz de clasificar correctamente al 87,5% de los pacientes con CaP según su agresividad.

    sTWEAK regula la expresión de NLK y TCF12, genes diana del exomiR-221-3p, ofreciendo nuevas vías para el tratamiento del CaP.

  • català

    El principal problema davant del càncer de pròstata (CaP) és la manca de biomarcadors per diagnosticar tumors agressius. Diferents citocines proinflamatòries alteren el metabolisme tumoral i la secreció de vesícules extracel·lulars (VEs), modificant el seu càrrec de microRNAs (exomiRNAs). TWEAK és una citocina proinflamatòria de la família del TNF que es troba tant unida a membrana (mTWEAK) com soluble (sTWEAK) i implicada en càncer mitjançant el receptor, Fn14. Estudiem si la presència de sTWEAK al microambient del CaP altera el metabolisme tumoral i la utilitat dels nivells sèrics de sTWEAK com a biomarcador. Les dades indiquen que nivells sèrics disminuïts de sTWEAK són predictors independents del CaP. A més, sTWEAK altera el metabolisme lipídic activant les vies d'ERK i AKT mitjançant Fn14, regulant l'expressió de gens involucrats en la lipogènesi de novo o la lipòlisi i mobilitzant i acumulant lípids in vitro a la línia cel·lular PC-3. D'altra banda, avaluem l'efecte de sTWEAK sobre la secreció de VE. Identifiquem 14 exomiRNA regulats in vitro per sTWEAK a les línies cel·lulars LNCaP i PC-3. D'aquests, l'expressió de l'exomiR-221-3p, -222-3p i -31-5p estava elevada en semen de pacients amb CaP d'Alt Risc respecte dels de Baix Risc, mentre que en orina de pacients d'Alt Risc l'expressió de l'exomiR-193-3p i -423-5p era menor. Dissenyem un model, format per l'expressió de l'exomiR-221-3p i -222-3p i els nivells seminals de sTWEAK, que classifica correctament el 87,5% dels pacients segons l'agressivitat. A més, sTWEAK regula in vitro dues dianes específiques de l'exomiR-221-3p relacionades amb la progressió tumoral a la línia cel·lular PC-3, el factor de transcripció 12 (TCF12) i el Nemo-like Kinase (NLK). En conclusió, les dades impliquen l'eix TWEAK/Fn14 en la progressió del CaP ja que n'alteren el metabolisme i l'activitat cel·lular.

  • English

    The main problem with prostate cancer (PCa) is the lack of biomarkers to diagnose aggressive tumors. Different proinflammatory cytokines alter tumor metabolism and the secretion of extracellular vesicles (EVs), modifying their microRNAs cargo (exomiRNAs). TWEAK is a proinflammatory cytokine of the TNF family that is both membrane-bound (mTWEAK) and soluble (sTWEAK) and is implicated in cancer through its receptor, Fn14. We study whether the presence of sTWEAK in the PCa microenvironment alters tumor metabolism and the usefulness of serum sTWEAK levels as a biomarker. The data indicate that decreased serum levels of sTWEAK are independent predictors of PCa. Furthermore, sTWEAK alters lipid metabolism by activating the ERK and AKT pathways via Fn14, regulating the expression of genes involved in de novo lipogenesis or lipolysis, and mobilizing and accumulating lipids in vitro in the PC-3 cell line. On the other hand, we evaluated the effect of sTWEAK on the secretion of VEs. We identified 14 exomiRNAs regulated in vitro by sTWEAK in the LNCaP and PC-3 cell lines. Of these, the expression of exomiR-221-3p, -222-3p and -31-5p was elevated in semen from patients with High Risk PCa compared to those Low Risk, while in urine from High Risk patients the expression of exomiR-193-3p and -423-5p was lower. We designed a model, composed of relative expression seminal levels of exomiR-221-3p and -222-3p and seminal sTWEAK levels, which correctly classifies 87.5% of patients based on aggressiveness. In addition, sTWEAK in vitro regulates two specific targets of exomiR-221-3p related to tumor progression in the PC-3 cell line, transcription factor 12 (TCF12) and Nemo-like Kinase (NLK). In conclusion, the data implicate the TWEAK/Fn14 axis in PCa progression since they alter its metabolism and cellular activity.