Desarrollo de un método cuantitativo para la determinación de la proteín tirosín fosfatasa SHP-1 y estudio de aspectos funcionales de esta proteína
- Autores: Constantino Cespón Otero
- Directores de la Tesis: Pedro González-Porque (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 1998
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Antonio Sillero Repullo (presid.), Margarita Fernández Martín (secret.), Eladio Montoya Melgar (voc.), Juan José López Fando Castro (voc.), Miguel López Botet (voc.)
- Materias:
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- Resumen
SHP-1 es una protein tirosin fosfatasa citoplasmática que se expresa mayoritariamente en células hematopoieticas:
en este trabajo describimos un método cuantitativo para la detección de SHP-1 en extractos celulares; basado en un Elisa de doble reconocimiento entre el mAb 2F12 y un anticuerpo policlonal generado en nuestro laboratorio: la sensibilidad del ensayo es de 0.5 ng manteniendo un rango lineal entre 0.2 - 4 ng. Como curva standard utilizamos SHP1 recombinante y nativa; plurificada por afinidad de la fracción citosólica de bazo humano los valores obtenidos con ambas curvas se compararon mediante el coeficiente de correlación obteniéndose un valor de r=0,99 utilizando este método analizamos el contenido de SHP1 en líneas celulares; linfocitos de bazo y leucemias; no detectando la expresión de SHP1EN los linfocitos procedentes de un paciente con el síndrome de Sezary; ni en la linea celular relacionada, HUT-78 estos resultados se confirmaron mediante Western y Northern Blot. Se ha estudiado la especificidad de sustrato de SHP1 utilizando como sistema la fracción citosólica de plaquetas humanas inactivadas; y fosforiladas con la PTK SRC: en este sistema SHP1 no mostró especificidad de sustrato desfosforilando la mayoría de las bandas fosforiladas por SRC. Como posible mecanismo de regulación analizamos el efecto de oxidantes y reductores sobre la actividad enzimática de SHP1 el GSSG puede inhibir la actividad del enzima a concentraciones proximas a las fisiologicas probablemente a través de la formación de puentes disulfuro con los grupos TIOL del enzima. La identificación de LAGST PI humana como la proteína UQ copurifica con SHP1 de bazo y su posible regulador sobre la actividad fosfatasa; son también discutidos.
