Alteraciones de la Expresión Génica Inducidas por Proteasas Virales

• Autores: Alfredo Castelló Palomares
• Directores de la Tesis: Luis Carrasco (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2008
• Idioma: español
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Biología molecular
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• Resumen

  • ÍNDICE ABREVIATURAS Abreviaturas 1 SUMMARY Resumen en inglés (Summary) 3 INTRODUCCIÓN 1. La iniciación de la traducción en eucariotas 5 1.1.1. Formación del complejo de preiniciación 43S 5 1.1.2. Unión del complejo de preiniciación 43S al mRNA 7 1.1.3. Migración del complejo de preiniciación 43S a través del mRNA 8 1.1.4. Unión de la subunidad ribosómica 60S al complejo de preiniciación 9 1.2. El factor de iniciación de la traducción 4G (eIF4G) 9 1.2.1. La familia de factores eIF4G 9 1.2.2. Estructura y función de eIF4G 10 1.3. La proteína de unión a la cola de poli(A) (PABP) 13 1.3.1. Estructura de las formas de PABP citoplásmicas 13 1.3.2. Papel de PABP en la síntesis de proteínas 14 1.4. Modificación de la maquinaria de traducción y transcripción por 15 proteasas virales 1.4.1. Proteolisis de eIF4G por proteasas virales 16 1.4.2. Papel del corte de eIF4G en la iniciación de la traducción 17 dependiente de cap y en la iniciación interna 1.4.3. Proteolisis de PABP por proteasas virales 19 1.4.4. Proteolisis de otros factores implicados en la traducción 20 1.4.5. Interferencia de las proteasas de picornavirus con el núcleo celular 20 OBJETIVOS Objetivos 23 Índice II MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. Manipulación de células bacterianas 25 2.1.1. Bacterias 25 2.1.2. Medios de Cultivo para E. coli 25 2.1.3. Mantenimiento y crecimiento de bacterias 25 2.1.4. Obtención de bacterias competentes 25 2.1.5. Transformación de E.coli por choque térmico 25 2.1.6. Obtención de DNA plasmídico 26 2.2. Manipulación de ácidos nucleicos 26 2.2.1. Manipulación del DNA en procesos de clonación 26 2.2.2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 26 2.2.3. Oligonucleótidos 26 2.2.4. Separación electroforética de DNA y RNA en geles de agarosa 26 2.2.5. Extracción de DNA de geles de agarosa 27 2.2.6. Plásmidos 27 2.2.7. Extracción de RNA y RT-PCR a tiempo real 30 2.2.8. Transcripción in vitro 30 2.2.9. siRNAs 31 2.2.10. Aislamiento del RNA nuclear y citoplasmático de células 31 de mamífero 2.2.11. Ensayo de splicing in vitro 31 2.2.12. Traducción in vitro 32 2.3. Manipulación de células de mamífero y virus 33 2.3.1. Líneas celulares de mamífero 33 2.3.2. Virus 33 2.3.3. Mantenimiento y cultivo de líneas celulares 34 2.3.4. Expresión transitoria en células de mamífero 34 2.3.5. Ensayo de splicing en células en cultivo 35 2.3.6. Marcaje metabólico de proteínas y obtención de extractos 35 2.3.7. Microscopía óptica 35 2.3.8. Microscopía confocal 35 2.3.9. Detección de los mRNAs por hibridación in situ (FISH) 36 2.4. Manipulación de proteínas 36 2.4.1. Electroforesis en geles de poliacrilamida 36 2.4.2. Tinción con azul de Coomassie y fluorografía-autorradiografía 36 Índice III 2.4.3. Inmunodetección de proteínas por western blot 37 2.4.4. Sueros y anticuerpos 37 2.4.5. Valoración de la concentración de proteínas 39 2.4.6. Aislamiento de proteínas del núcleo y citoplasma de células 40 de mamífero 2.4.7. Purificación de proteínas 40 2.4.8. Ensayos proteolíticos 40 2.4.9. Medida de la actividad luciferasa 40 RESULTADOS 3.1. Efecto de la hidrólisis de eIF4GI y eIF4GII en la traducción de mRNAs 41 celulares y virales 3.1.1. Transfección de células HeLa con mRNAs que codifican para 41 la proteasa 2A del PV: efecto en la síntesis de proteínas celulares 3.1.2. Corte diferencial de eIF4GI y eIF4GII en células HeLa X1/5: 43 efecto en la traducción de mRNAs pre-existentes o sintetizados de novo 3.1.3. Requerimiento diferencial de eIF4GI y II para la traducción 47 de los mRNAs de Luc sintetizados de novo o pre-existentes 3.1.4. Repercusión de la hidrólisis de eIF4GI y eIF4GII en la traducción 49 de distintas variantes de mRNAs de luciferasa transcritos in vitro 3.1.5. Estudio de la iniciación de la traducción en células transfectadas 51 con EMC-2A 3.1.6. Efecto del corte de eIF4GI y eIF4GII en la traducción dirigida por 52 los IRES de picornavirus 3.1.7. Efecto del corte de eIF4GI y eIF4GII en la traducción del mRNA 55 de Hsp70 3.1.8. Correlación de la inhibición de la síntesis de proteínas celulares con 58 la proteolisis de eIF4GII en células BHK 3.1.9. Depleción de las proteínas de la familia eIF4G en células humanas 59 3.1.10. Crecimiento celular y síntesis de proteínas en situaciones de déficit 62 de factores de iniciación de la traducción 3.2. Alteración del splicing y de la exportación de mRNAs del núcleo al 65 citoplasma por la proteasa 2A del PV 3.2.1. Alteración de la exportación de RNAs del núcleo al citoplasma 65 por 2Apro Índice IV 3.2.2. Localización subcelular de los mRNAs en células transfectadas 68 con e EMC-2A 3.2.3. Localización subcelular de los productos de corte de eIF4GI y eIF4GII 70 en células que expresan 2Apro 3.2.4. Distribución de los mRNAs en células depletadas de eIF4GI y eIF4GII 72 3.2.5. Efecto de 2Apro en el splicing de mRNAs 74 3.2.6. Splicing in vitro en presencia de proteasas virales 77 3.3. Hidrólisis de PABP por la proteasa de HIV. Efectos en la síntesis 78 de proteínas 3.3.1. PABP es hidrolizada en células infectadas con HIV-1 78 3.3.2. El corte de PABP es inducido por la proteasa de HIV-1 y de 79 otros retrovirus 3.3.3. La hidrólisis de PABP por HIV-1 y -2 PR ocurre simultáneamente 79 a la de eIF4GI in vitro 3.3.4. Las proteasas de HIV-1 y -2 hidrolizan de forma directa PABP. 80 Caracterización de los sitios de procesamiento 3.3.5. Efecto de HIV-1 PR y MBP-2Apro en la traducción de mRNAs 82 exógenos en extractos de células HeLa 3.3.6. Efecto de HIV-1 PR y MBP-2Apro en la traducción de mRNAs 84 exógenos y endógenos en extractos de células Krebs-2 3.3.7. HIV-1 PR inhibe la traducción dependiente de cola de poli(A) 86 mediante el corte de PABP 3.3.8. Efecto de la hidrólisis de PABP en la traducción dirigida por el 87 IRES de EMCV 3.4. Papel de eIF4G en la expresión del virus sindbis 91 3.4.1. Producción de SV recombinantes que expresan HIV-1 PR o 2Apro. 91 Efecto en la síntesis de proteínas, en la replicación viral y en la producción de partículas infectivas 3.4.2. Efecto del corte de eIF4G en la traducción del RNA genómico de SV 95 3.4.3. Relevancia de la secuencia líder 26S en la traducción cap- 97 independiente de los mRNAs subgenómicos del SV-GFP 3.4.4. Análisis de la secuencia líder 26S. Requerimiento de los mRNAs 99 subgenómicos quimera de eIF4G para su traducción.

    3.4.5. Efecto del corte de eIF4G en la traducción de mRNAs 100 subgenómicos exógenos del SV transfectados en células de mamífero Índice V DISCUSIÓN 4.1. Efecto de la hidrólisis de eIF4GI y eIF4GII por la proteasa 2A del PV 103 en la traducción de mRNAs celulares y virales 4.2. Inhibición del splicing y de la exportación de RNAs desde el núcleo por la 106 proteasa 2A del PV 4.3. La proteasa de HIV hidroliza PABP. Efecto en la traducción de mRNAs 109 celulares y virales 4.4. Efecto de la hidrólisis de eIF4GI, eIF4GII Y PABP en la traducción 112 de los RNAs del SV CONCLUSIONES Conclusiones 115 BIBLIOGRAFÍA Bibliografía 117