Resurrected ancestral proteins as scaffolds for enzyme engineering and evolution

• Autores: Luis Ignacio Gutiérrez Rus
• Directores de la Tesis: José Manuel Sánchez Ruiz (codir. tes.), Valeria Alejandra Risso (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2023
• Idioma: inglés
• ISBN: 9788411179676
• Número de páginas: 229
• Tribunal Calificador de la Tesis: Mª Ángeles Jiménez López (presid.), Sergio Martínez Rodríguez (secret.), Erich Bornberg Bauer (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Química por la Universidad de Granada
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Proteínas
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
• Resumen
  • español

    Las enzimas son máquinas moleculares naturales extraordinariamente eficientes que catalizan las reacciones y transformaciones químicas que sustentan la vida de todos los organismos. Décadas de investigación intensiva han logrado avances significativos en el estudio de las enzimas. Los investigadores han desarrollado metodologías y aproximaciones sofisticadas para estudiar de manera extensiva y conseguir un conocimiento en profundidad sobre sobre las bases moleculares de la estructura, dinámica, función y regulación de las enzimas. Como resultado, hoy en día es posible describir de forma precisa las implicaciones fisicoquímicas de cada elemento involucrado en el sitio activo de prácticamente cualquier enzima durante los procesos moleculares específicos que permiten las reacciones catalíticas. Además, el conocimiento extensivo sobre la catálisis enzimática nos ha permitido entender cómo las enzimas han evolucionado durante miles de millones de años de selección natural para catalizar reacciones químicas con eficiencia, especificidad y selectividad excelentes con respecto a las reacciones de transformación y sus sustratos. En general, el estudio de las enzimas ha abierto una fascinante ventana a la maquinaria molecular de la vida. Pero, además, ha permitido a los investigadores acumular una sólida base de conocimiento científico que podemos aplicar en el diseño, modificación y optimización de la arquitectura molecular de las enzimas con el objetivo de diseñar versiones artificiales y modificadas de enzimas a medida para catalizar reacciones químicas de interés biotecnológico y biomédico. A pesar del extenso y avanzado conocimiento sobre los fundamentos y la evolución de la catálisis enzimática, sigue habiendo una pregunta elemental sin respuesta con respecto al estudio de las enzimas: ¿Cómo emergió y evolucionó la catálisis enzimática por primera vez durante el origen de las proteínas y las enzimas? La capacidad de entender los mecanismos moleculares que subyacen a la emergencia evolutiva de nuevas capacidades catalíticas en enzimas no solo es fundamental para entender el nacimiento de las enzimas y sus implicaciones en el origen de la vida. Además, es crítica para diseñar nuevas aproximaciones biotecnológicas inspiradas en estos mecanismos moleculares con el objetivo de diseñar y generar de forma eficiente nuevas enzimas para catalizar reacciones químicas artificiales no naturales de interés. Sin embargo, el estudio basado en enzimas modernas, encontradas en los organismos actuales, con el objetivo de responder a esta pregunta fundamental no logrado avances significativos. En esta tesis proponemos la hipótesis de que las proteínas ancestrales resucitadas podrían funcionar como mejores “andamios moleculares”, en comparación con sus homologas modernas, para estudiar y comprender la emergencia de la catálisis enzimática. El estudio de sitios activos ancestrales y sus arquitecturas moleculares podría ser más útil para revelar y estudiar los requerimientos mínimos necesarios para la catálisis enzimática. Además, las proteínas ancestrales podrían ser mejores puntos de inicio para el diseño de sitios nuevos sitios activos para catalizar reacciones químicas no naturales artificiales. En este sentido, lograr avances en ambas direcciones tendría importantes implicaciones para entender y revelar los procesos moleculares que dirigen la emergencia de nuevas catálisis enzimáticas en la naturaleza. Por lo tanto, las proteínas ancestrales muestran de potencial de tener un profundo impacto en nuestra comprensión sobre la catálisis enzimática, con implicaciones críticas en nuestro conocimiento sobre el origen de la vida y la capacidad de desarrollar nuevas enzimas artificiales. Para validar nuestra hipótesis, hemos realizado diferentes experimentos con diferentes sistemas de proteínas ancestrales resucitadas con el objetivo de evolucionar un sitio activo artificial de novo y de entender cómo niveles primordiales de catálisis dependiente de un cofactor son mejorados en un andamio molecular ancestral sin evolucionar. En la primera parte de la tesis describimos la evolución de un sitio activo artificial de novo, previamente diseñado en el andamio molecular de una β-lactamasa ancestral mediante cribados computacionales y experimentales de bajo número. Como resultado, hemos demostrado cómo mutaciones en residuos directamente involucrados en el sitio activo artificial o cómo la introducción de nuevos residuos adicionales en la secuencia de la proteína puede mejorar la preorganización geométrica del sitio activo y generar nuevas interacciones que aumentan la estabilización del estado de transición y mejoran los bajos niveles de actividad enzimática para llegar a una catálisis enzimática eficiente comparable a la de enzimas naturales. Estos resultados tienen implicaciones inmediatas en ingeniería de proteínas y el diseño de novo de enzimas. Pero, adicionalmente, aporta nuevo conocimiento sobre los mecanismos evolutivos que pudieron dar lugar a la optimización temprana de sitios activos nuevos durante la emergencia de la catálisis enzimática. En la segunda parte de esta tesis, hemos resucitado una glicosidasa ancestral que presenta un plegamiento típico en forma de barril TIM y que muestra unas propiedades bioquímicas y biofísicas inusuales. Principalmente, nuestro barril TIM ancestral muestra la capacidad de unir una molécula del cofactor redox hemo en una región excepcionalmente flexible de arquitectura del barril. La unión del hemo da lugar a un aumento general de la rigidez de la estructura de la proteína, a una modulación alostérica de la actividad natural de la enzima y a la generación de una actividad peroxidasa nueva no natural basada en el poder catalítico redox intrínseco del hemo. Como resultado, nuestra proteína ancestral con estructura de barril TIM y con la capacidad de unir hemo demuestra el potencial de la resurrección ancestral de proteínas como andamios que muestran combinaciones inusuales de propiedades con interés biotecnológico. Adicionalmente, el estudio de nuestro barril TIM con actividad redox aporta nuevos puntos de vista sobre el papel de la protección de los cofactores durante la emergencia de las proteínas y la catálisis enzimática durante en origen de la vida. En general, los resultados presentados en esta tesis apoyan la hipótesis de que las proteínas ancestrales resucitadas pueden servir como mejores andamiajes moleculares en la ingeniería y estudios evolutivos de enzimas, dirigidos a lograr un mayor conocimiento sobre la emergencia de la catálisis enzimática durante el origen de la vida.

  • English

    Enzymes are extraordinary efficient natural molecular machines that catalyze chemical reactions and transformations that sustain life in all organisms. Decades of intensive research have led to significant advances in the study of enzymes. Researchers have developed sophisticated methodologies and approaches to extensively study and gain an in-depth understanding of the molecular basis of enzyme structure, dynamics, function, and regulation. As a result, it is now possible to accurately describe the physiochemical implications of every element involved in almost every enzyme’s active site during the specific molecular processes that drive the catalytic reactions. Moreover, the extensive knowledge about enzymatic catalysis has allowed us to understand how enzymes have evolved during billions of years of natural selection to catalyze chemical reactions with proficient efficiency, specificity and selectivity towards the chemical transformations and their substrates. Overall, the study of enzymes has provided a fascinating window into the molecular machinery of life. But also, it has allowed researchers to accumulate a solid scientific knowledge base that enables to engineer and tune the molecular architecture of enzymes towards designing efficient artificial and modified versions of tailored enzymes for catalyzing chemical reactions of biotechnological and biomedical interest. However, despite our deep knowledge and advanced understanding about the fundamentals and evolution of enzymatic catalysis, one elemental question remains unanswered – How enzymatic catalysis firstly emerged and evolved at the origin of proteins and enzymes? Understanding the molecular mechanisms underlying the evolutionary emergence of new enzymatic catalysis would not only be essential to understand the birth of enzymes and its implications in the origins of life. But also, it would be critical to design new biotechnological approaches inspired in these molecular mechanisms to efficiently design and generate novel enzymes to catalyze artificial unnatural chemical reactions of interest. Yet, the study of modern enzymes with the aim to shed some light on this fundamental question has not provided significant advances. In this thesis, we propose the hypothesis that resurrected ancestral proteins might be better scaffolds than their modern counterparts to study and understand the emergence of enzymatic catalysis. Ancestral active sites and their molecular architectures would be more useful to reveal and study the minimal requirements for catalysis. But also, ancestral proteins might be better starting points for engineering novel active sites to catalyze artificial unnatural chemical reactions. Advances in both directions may help us to reveal the molecular processes that drive the emergence of new catalysis in nature. Ancestral proteins then show the potential to have a profound impact in our understanding about enzyme catalysis, with critical implications in our knowledge about the origins of life and our capacity to develop new artificial enzymes. In order to validate our hypothesis, we have performed several experiments with different resurrected ancestral protein systems aiming to evolve a de novo artificial active site, as well as to understand how primordial levels of cofactor-dependent catalysis are promoted in an unevolved ancestral molecular scaffold. In the first part of the thesis, we describe the evolution of an artificial de novo active site, previously engineered in a resurrected ancestral β-lactamase scaffold, by means of computational and experimental low-throughput screenings. As a result, we have demonstrated how mutations in residues directly involved in a de novo active site or how the introduction of new additional residues in the protein sequence may improve the geometrical preorganization of the active site and generate new interactions that enhance the stabilization of the reaction transition state and promote low initial levels of activity to reach an efficient enzymatic catalysis comparable to natural enzymes. These results have direct implications in protein engineering and de novo enzyme design. But also, it provides new insights about the evolutionary processes that may led the early optimization of novel active sites during the emergence of enzymatic catalysis. In the second part of the thesis, we have resurrected an ancestral glycosidase protein with a typical TIM-barrel fold that displays unusual biochemical and biophysical features. Mainly, our ancestral TIM-barrel shows the ability to bind a molecule of the redox cofactor heme in a highly flexible region of the barrel architecture. Upon heme binding, the ancestral TIM-barrel displays a general rigidification of its structure, an allosteric modulation of its natural enzymatic activity and an unnatural novel peroxidase activity based on the redox catalytic power of heme. As a result, the ancestral heme binding TIM-barrel protein demonstrates the potential of resurrected proteins as scaffolds to harbor unusual combinations of properties of evolutionary and biotechnological interest. Additionally, the study of our redox active TIM-barrel provides new insights about the role cofactor protection in the emergence of proteins and enzymatic catalysis during the origin of life. Overall, the results presented in this thesis support the hypothesis that resurrected ancestral proteins may serve as superior scaffolds for enzyme engineering and evolutionary studies, aimed to better understand the emergence of enzymatic catalysis during the origin of life.