Calorimetric force spectroscopy experiments in dna and protein folding
- Autores: Marc Rico Pastó
- Directores de la Tesis: Felix Ritort Farran (dir. tes.), Giancarlo Franzese (tut. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2022
- Idioma: inglés
- Tribunal Calificador de la Tesis: Javier Sancho Sanz (presid.), Fredrik Westerlund (secret.), Yael Roichman (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Física por la Universidad de Barcelona
- Materias:
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- Resumen
En esta tesis se han realizado experimentos de molécula individual en equilibrio y no-equilibrio mediante unas pinzas ópticas con controlador de temperatura para determinar la energía libre, entalpía y entropía en función de la temperatura durante el plegamiento de la proteína barnasa y diferentes horquillas de ADN. En partir de estas medidas, se ha derivado el cambio de capacidad calorífica por par de base en la reacción de hibridación del ADN. Además, con una metodología desarrollada en esta tesis, los datos obtenidos han permitido caracterizar las propiedades termodinámicas del estado de transición. Los resultados obtenidos han demostrado que el estado de transición presenta las características termodinámicas predichas por el modelo de proteína fundida desarrollado en los años 80-90 para explicar el plegamiento molecular. Caracterizar este estado presenta grandes complicaciones en experimentos clásicos de granel donde un gran número de moléculas son estudiadas a la vez. Sin embargo, los experimentos de molécula individual presentados en esta tesis doctoral han permitido caracterizar con una precisión sin precedentes todos los potenciales termodinámicos del mismo estado.
Paralelamente, se ha derivado un teorema de fluctuación (TF) para estudiar experimentos de no equilibrio aplicando un protocolo de retroalimentación general. Dicho TF ha sido estudiado experimentalmente y mediante simulaciones numéricas para estudiar la conversión de información en energía y encontrar las condiciones óptimas para reducir la disipación. Basado en los resultados obtenidos, se ha introducido un nuevo concepto en el campo, que hemos denominado Estrategia de Retroalimentación. Dicha estrategia ha sido estudiada mediante distintas simulaciones numéricas.
Por último, se han realizado dos colaboraciones, una para extender una metodología conocida como CEBA (acrónimo de Continus Effective Barrier Aproach en inglés) que permite caracterizar la barrera efectiva que media transiciones entre el estado nativo y desnaturalizado para moléculas de ADN/RNA y proteínas. En particular, se ha estudiado el plegamiento de horquillas de ADN que presentan estados intermedios como modelo simple para demostrar las bondades de la metodología extendida. Además, se ha estudiado dos horquillas de ADN pequeñas que se pliegan con y sin estado intermedio en un amplio rango de temperaturas para derivar la respuesta en temperatura de la barrera efectiva. En segundo lugar, la otra colaboración ha estudiado la interacción del ADN con ligandos que se unen de forma débil a la doble-hélice de AND mediante experimentos de no equilibrio en diferentes concentraciones de ligando. En concreto, se ha usado la droga conocida como Netropsina para demostrar las bondades del método propuesto en esta sección. Este ligando tiene la particularidad que se puede unir de dos formas al ADN: de forma específica a motivos 5’ –AATT-3’ o de forma no específica a zonas ricas en pares de bases AT. Mediante los experimentos mencionados, se ha determinado las propiedades cinéticas de ambas uniones, así como la energía de unión.
