Resumen de Role of the nadph oxidase nox4 in hepatocyte proliferation. Relevance on liver regeneration
La familia de las NADPH oxidasas ha emergido en los últimos años como una importante fuente de producción de radicales libres de oxígeno (ROS), los cuáles juegan un papel fundamental en situaciones fisiológicas y patológicas. Dentro de la familia, NOX4 presenta características únicas en comparación con el resto de miembros de la familia. Su principal producto es peróxido de hidrógeno (H2O2) y está constitutivamente activa. En el hígado, NOX4 media los efectos del Factor de Crecimiento Transformante beta (Transforming Growth Factor- β, TGF-β) en el desarrollo de fibrosis y carcinogénesis hepática. Por un lado, nuestro grupo y otros han descrito que NOX4 contribuye en la transdiferenciación de las células estrelladas a miofibroblastos. De esta manera, se están desarrollando inhibidores de NOX4 para poder tratar la fibrosis hepática. Por otra parte, NOX4 media los efectos supresores de TGF-β, induciendo apoptosis en hepatocitos. Además, el silenciamiento de NOX4 en células de hepatocarcinoma celular les confiere mayor capacidad proliferativa y migratoria in vitro y mayor potencial tumorigénico in vivo. Además, deleciones en el gen de NOX4 se encontraron en pacientes de hepatocarcinoma celular.
La regeneración hepática es la respuesta a la pérdida de tejido hepático, la cual se puede producir por un daño tóxico, en respuesta a infección, o a una resección quirúrgica, entre otros. La hepatectomía parcial es el modelo más extendido para estudiar la regeneración hepática en modelos murinos. Citoquinas, factores de crecimiento y vías metabólicas están implicadas en el proceso regenerativo, aunque la complejidad del proceso conlleva que muchos mecanismos sigan siendo motivo de estudio. De esta manera, poco se conoce sobre el papel de las NADPH oxidasas durante el proceso de regeneración hepática. Resultados previos del grupo demostraron que los niveles de NOX4 disminuyen en situaciones proliferativas del hígado, como la regeneración hepática tras hepatectomía parcial del 70%.
Considerando la importante función de NOX4 en enfermedades crónicas del hígado, así como su posible inhibición como tratamiento anti-fibrótico, es importante estudiar cuáles serían las consecuencias de su inhibición durante el proceso de regeneración. Por ello, el objetivo de esta tesis es estudiar el papel potencial de NOX4 durante el proceso de regeneración tras hepatectomía parcial del 70%, usando modelos animales donde la expresión de NOX4 ha sido eliminada en todas las células (NOX4-/-) o específicamente en los hepatocitos (NOX4hepKO). Además, se usaron hepatocitos primarios obtenidos de dichos modelos animales para analizar las posibles diferencias en proliferación, así como la respuesta a TGF-β.
Los resultados obtenidos en el estudio in vivo muestran que la deleción de NOX4 en los ratones, tanto en los hepatocitos (NOX4hepKO) como en todas las células del organismo (NOX4-/-), aceleraba la recuperación del ratio masa hepática/masa corporal tras la hepatectomía parcial. Además, la supervivencia tras la intervención era mayor en los ratones que no tenían NOX4 en comparación con los ratones control (WT). Curiosamente, el ratio masa hepática/masa corporal a las 4 semanas después de la hepatectomía no era mayor que el ratio inicial en el modelo NOX4-/-, lo cual sugiere que Nox4 no es imprescindible para la terminación de la regeneración. Por otra parte, estudios histológicos mostraron que el parénquima recuperaba su estructura normal antes y que la esteatosis hepática típica de la regeneración se resolvía más rápidamente en los ratones que no tenían Nox4.
Además, la deleción de NOX4 específicamente en el hepatocito confería una ventaja proliferativa a los ratones, que mostraban mayores y anticipados niveles de Ki67 e Histona 3 fosforilada, en comparación con los ratones WT. Esta mayor proliferación coincidía con una mayor inducción del factor de transcripción c-Myc, tanto a nivel de transcripción, como de traslocación al núcleo. Además, hepatocitos primarios aislados de los ratones que tenían NOX4 delecionado mostraban un mayor porcentaje de células viables y mayor inducción de ciclinas D1, A2 y B2 en respuesta a suero bovino fetal (FBS).
Un estudio transcriptómico demostró que el mayor número de diferencias entre WT y NOX4-/- se producían 24 horas tras la hepatectomía parcial. Además de Myc, otros factores de transcripción (como Egr1 y Fosb), y el factor de crecimiento HB-EGF (Hbegf) mostraban una mayor inducción a las 24 horas tras la hepatectomía en ratones NOX4-/- en comparación con WT. Uno de los mecanismos inhibidores más importantes de Myc es TGF-β. El estudio transcriptómico también demostró que los niveles del ligando TGF-β1 eran más bajos en NOX4-/- que en WT, y que algunos de los genes que codifican las proteínas implicadas en la activación de TGF-β (por ejemplo, Bmp1 o Adamtsl2) también tenían una expresión diferencial en NOX4 versus WT. Estas diferencias coincidían con niveles más bajos de TGF-β1 activo, menor porcentaje de núcleos positivos para Smad3 y menor fosforilación de Smad3 en los ratones que no tenían NOX4. Curiosamente, los hepatocitos primarios aislados de estos ratones tenían una respuesta a TGF-β similar a la respuesta de los hepatocitos primarios WT, en términos de fosforilación de Smad2 y disminución de proliferación y c-Myc.
Además, el análisis transcriptómico sugirió que la recuperación anticipada de la esteatosis en NOX4-/- podía ocurrir debido a una β-oxidación de ácidos grasos más eficiente. Los ratones NOX4-/- tenían niveles más altos de algunos genes que codifican proteínas implicadas en la oxidación de ácidos grasos, como algunos miembros de la familia PPAR (PPAR-δ, Ppard; PGC-1β, Ppargc1b; Cyp4a10 y Cyp4a14, dianas de PPAR-α).
Por último, considerando que las intervenciones quirúrgicas son el tratamiento para algunas enfermedades hepáticas, y que éstas pueden llevarse a cabo en personas adultas, se llevó a cabo un estudio en el cuál se demostró que el silenciamiento de NOX4 en ratones de 1 año de edad también favorecía el proceso de regeneración hepática tras hepatectomía parcial del 70%.
En conclusión, Nox4 se ha propuesto como una diana potencial en el tratamiento de enfermedades hepáticas crónicas. Los resultados presentados en esta tesis demuestran que la inhibición de Nox4 favorece la regeneración hepática del resto de hepatocitos sanos. Nox4 parece no ser necesaria en el proceso de terminación de la regeneración, lo cual favorece su potencial como diana terapéutica. Sin embargo, teniendo en cuenta que el silenciamiento de Nox4 favorece el crecimiento tumoral, dicha inhibición sólo debería ser considerada en estadios tempranos de la fibrosis.
