Enzimas modificadoras de la pared celular vegetal. Celulasas de interés biotecnológico papelero

• Autores: Liliana Cerda
• Directores de la Tesis: Francisco Ignacio Javier Pastor Blasco (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2016
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Teresa Vidal Llucia (presid.), Josefina Martínez Martínez (secret.), Pere Picart Faiget (voc.)
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Microbiología
      • Procesos microbianos
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: TESEO
• Resumen

  • La pared celular vegetal se compone de celulosa, hemicelulosas y lignina, que están fuertemente entrelazados y unidos por enlaces covalentes y no covalentes. La misma representa la fuente principal de celulosa, que constituye la materia prima para la fabricación de papel y una gran variedad de productos. El principal impedimento tecnológico para la utilización de la celulosa es la ausencia de una tecnología de bajo costo que disminuya la recalcitrancia de la misma. Se han desarrollado diversos métodos fisicoquímicos y biológicos que mejoran la despolimerización de la lignocelulosa. Los objetivos del trabajo se centraron en la identificación y caracterización de enzimas con capacidad de hidrólisis, oxidación o modificación de la celulosa, y su posterior aplicación en el refinado de la pasta de papel y en general en biotecnología de la biomasa. La primera enzima identificada fue la liquenasa de Paenibacillus barcinonensis BP-23, obtenida por el método del Genome Walking. La secuencia aminoacídica deducida del gen codificante, reveló que es una proteína monodominio perteneciente a la familia 16 de glicosil hidrolasas, fue nombrada: Lic16A, la cual mostró actividad exclusiva sobre β-1,3-1,4-glucanos y estabilidad a 55ºC durante 3h en condiciones moderadas de pH. El análisis mediante cromatografía de capa fina mostró que la enzima liberaba una mezcla compleja de oligosacáridos de diferente longitud y movilidad intermedia entre celooligosacáridos. Se efectuó la secuenciación del genoma de la cepa Paenibacillus barcinonensis BP-23 por la plataforma Illumina con la técnica HiSeq 2000, se realizó el ensamblaje de novo con el programa SGA. Después del ensamblaje parcial del genoma, se identificaron cuatro xilanasas nuevas, siete arabinofurosidasas putativas y una nueva celulasa, que fue nombrada Cel6D. La secuencia aminoacídica deducida de cel6D, la nueva celulasa identificada, reveló que es una proteína multidominio de la familia 6 de glicosil hidrolasas con la estructura GH6-Fn3-CBM3. Cel6D presenta todos los residuos cruciales para la actividad catalítica y mostró actividad exclusiva sobre celulosa cristalina, preferentemente sobre PASC, indicando que es un exoglucanasa. Cel6D presenta algunas limitaciones en termoestabilidad, ya que pierde el 80% de actividad en 15 min a 55ºC. El análisis mediante cromatografía de capa fina mostró que la enzima liberaba celobiosa como único producto de hidrólisis. La ingeniería de proteína de Cel6D, reveló que la enzima truncada, Cel6D-GH6, perdía la actividad hidrolítica, mientras que la enzima truncada Cel6D-GH6Fn3 perdió el 89% de actividad. Estos resultados demostraron la importancia de todos los módulos que componen la enzima. Para evaluar la posibilidad de un efecto cooperativo entre celulasas, se estudió el sistema endo-exo entre endoglucanasas (Cel9B, Cel5A de P. barcinonensis) y la exoglucanasa (Cel6D). Se evidenció sinergismo entre Cel9B y Cel6D sobre sustratos celulósicos insolubles, mientras que no se encontró efecto sinérgico entre Cel5A y Cel6D. Se identificó una enzima con homología a LPMO’s en la cepa Paenibacillus illinoisensis, aislada de suelos subtropicales de Brasil, que fue nombrada CBP3. A pesar de la alta homología de esta enzima con LPMO’s caracterizadas no se logró obtener resultados positivos de actividad despolimerizante en los ensayos realizados sobre sustratos celulósicos de laboratorio. Sin embargo se obtuvo liberación de azúcares a partir de pastas de papel. El uso de enzimas modificadoras sin actividad hidrolítica podría facilitar la degradación de la celulosa. Otra enzima estudiada fue la expansina BsEXLX1 de Bacillus subtilis, que al ser aplicada en pastas de lino, causó una modificación en la estructura de las fibras, que presentaron una anchura incrementada. La aplicación de Cel6D de P. barcinonensis en pastas de lino ECF, potencia su respuesta al refinado. Se consiguió una aceleración de los efectos primarios y secundarios del refinado y una mayor hidratación en la matriz interna de las fibras, que favorecen los mecanismos de cohesión interfibrilar. Como resultado se obtuvo una notable mejora de las propiedades de resistencia mecánica del papel. La simultánea disminución de la densidad que causa la aplicación de la enzima es un hecho diferencial y único de la exoglucanasa Cel6D. El efecto de biorefinado producido permite catalogar a la enzima Cel6D como “coadyuvante del refinado”. Su aplicación permite reducir la energía de refinado para conseguir determinadas propiedades de resistencia.