Resumen de Bases moleculares del reclutamiento de la maquinaria de autofagia por las proteínas WIPI
Las proteínas WIPI o PROPPIN son una familia de proteínas con estructura β-propeller que unen fosfoinosítidos y cuya función principal es permitir el reclutamiento de otras proteínas a distintas membranas celulares. Estas proteínas intervienen en varias etapas del proceso autofágico, así como en el reciclaje de proteínas desde el endosoma al aparato de Golgi. Se han identificado cuatro miembros de esta familia en humanos, WIPI1-4 y tres en la levadura Saccharomyces cerevisiae Atg18, Atg21 y Hsv2. Mutaciones en los cuatro genes humanos producen distintas enfermedades con fenotipo neurológico. El objetivo de esta tesis ha sido caracterizar los mecanismos de interacción y la función de las proteínas WIPI de levadura y analizar su posible conservación en humanos, lo que es clave para el estudio de las enfermedades asociadas. En la primera parte de este trabajo, demostramos que Hsv2, al igual que WIPI4 y Atg18, interacciona con Atg2. Estudios de microscopía muestran que el complejo Hsv2-Atg2 se localiza en endosomas en condiciones basales y en el sitio de ensamblaje del fagóforo (PAS) tras la inducción de la autofagia. Además, determinamos que el sitio de unión de Atg2 está conservado en Hsv2 y WIPI4, lo que es muy relevante ya que mutaciones en los residuos correspondientes en WIPI4 provocan la enfermedad BPAN. Finalmente, estudios funcionales sugieren que Hsv2 está implicada en la vía de reciclaje del endosoma al aparato de Golgi. En la segunda parte de este trabajo, profundizamos en los mecanismos moleculares de la interacción entre Atg21 y Atg16. Atg21 y su homólogo humano WIPI2, median el reclutamiento del complejo E3 de la maquinaria de lipidación a la membrana del fagóforo a través de su interacción con Atg16/ATG16L1, lo que permite la lipidación de Atg8/LC3 y la expansión del fagóforo. Utilizamos el sistema de dos híbridos en reverso para identificar los residuos en Atg16 y Atg21 implicados en la interacción entre estas dos proteínas y demostramos que su interrupción bloquea completamente la autofagia selectiva y parcialmente la no selectiva, lo que sugiere la existencia de un mecanismo alternativo de reclutamiento del complejo E3. Además, nuestros datos revelan que el sitio de unión de Atg16 en Atg21 está conservado en WIPI2, y estudios comparativos con el sitio de unión de Atg2/ATG2A en Hsv2 y WIPI4 indican que la posición de los residuos que forman el sitio de unión de Atg2/ATG2A y Atg16/ATG16L1 esta conservada en las distintas proteínas WIPI y que la especificad de unión está en parte determinada por el tipo de aminoácido en esta posición. En la tercera parte de este trabajo, con el objetivo de caracterizar el mecanismo de reclutamiento del complejo E3 al PAS independiente de Atg21, demostramos que la proteína Atg12, que forma parte de este complejo, interacciona con la proteína de andamiaje del complejo Atg1, Atg17. Además, identificamos los residuos involucrados en esta unión mediante el sistema de dos híbridos en reverso y analizamos el flujo autofágico de mutantes que bloquean la interacción, revelando una reducción parcial de la autofagia no selectiva. Finalmente, nuestros datos muestran que la combinación de la deleción de ATG21 con mutaciones que bloquean la unión entre Atg17 y Atg12 produce una reducción mayor del flujo autofágico, lo que sugiere que estos dos mecanismos actúan de forma coordinada en el reclutamiento del complejo E3 de lipidación al PAS
