Emerging viruses infecting solanaceous crops: genetic characterization of the pepper vein yellows virus complex and generation of tomato chlorosis virus infectious clones

• Autores: Elisa Navas Hermosilla
• Directores de la Tesis: Jesús Navas Castillo (dir. tes.), Elvira Fiallo Olivé (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Málaga ( España ) en 2023
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Carmelo López del Rincón (presid.), Juan Antonio Díaz Pendón (secret.), Luis Rubio Miguélez (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biotecnología Avanzada por la Universidad de Málaga
• Materias:
  • Ciencias agrarias
    • Fitopatología
      • Virus
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: RIUMA
• Resumen

  • Los virus son las entidades biológicas más abundantes en la Tierra, infectan a miembros de los tres superreinos de la vida (Bacterias, Arqueas y Eukarya) y sus pequeños genomas los obligan a ser parásitos intracelulares. Durante las últimas décadas, la humanidad ha enfrentado numerosos brotes de enfermedades infecciosas emergentes y reemergentes, causadas principalmente por virus, con importantes amenazas para la seguridad sanitaria, la economía global e incluso la biodefensa. La reciente pandemia causada por el coronavirus severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 es un ejemplo paradigmático de este fenómeno. Las enfermedades víricas emergentes no son exclusivas de los seres humanos u otros animales. Así, las plantas, incluidos los principales cultivos, han sido seriamente afectadas por enfermedades víricas emergentes en los últimos 30 años. La aparición de enfermedades víricas en las plantas está cada vez más asociada al transporte internacional de mercancías y al aumento de la temperatura global, lo que provoca el establecimiento de vectores donde antes no existían. Los virus de plantas son responsables de grandes pérdidas económicas y, a diferencia de los hongos y otros patógenos, no existen agentes antivirales directos disponibles para su control. El gran número de virus que infectan a las plantas constituye uno de los factores críticos que limitan la agricultura en todo el mundo, especialmente en los países menos desarrollados. Más del 70% de los numerosos virus de plantas transmitidos por insectos son transmitidos por miembros del orden Hemiptera, entre los que se encuentran los pulgones (Aphididae), los cicadélidos (Cicadellidae) y las moscas blancas (Aleyrodidae), vectores de virus pertenecientes a más de 500 especies. Estos insectos se distribuyen en regiones tropicales, subtropicales y templadas y algunos de ellos se están estableciendo en nuevas regiones debido al cambio climático global. Además, es importante destacar la amplia gama de huéspedes de algunos vectores hemípteros, como el pulgón Aphis gossypii o las moscas blancas del complejo Bemisia tabaci, lo que favorece la propagación de los virus. Los virus de plantas transmitidos por insectos se transmiten en modo no persistente, semipersistente o persistente, dependiendo del tiempo mínimo requerido para la adquisición y la duración máxima de retención de los viriones. El período mínimo de adquisición varía desde segundos a minutos para los virus no persistentes, desde minutos a horas para los semipersistentes y horas para los virus persistentes. Los virus no persistentes y semipersistentes son típicamente transmitidos por el estilete y el tracto digestivo anterior, respectivamente. Los virus persistentes se desplazan desde el tracto digestivo anterior hacia el medio y el intestino posterior, desde donde se transportan a la hemolinfa y luego a las glándulas salivales para ser liberados en los tejidos de las plantas. Los virus persistentes pueden replicarse (propagativos) o no (no propagativos) en el cuerpo del vector.

    Actualmente, los virus de las plantas se incluyen en más de 100 géneros agrupados en 24 familias. La mayoría de las familias de virus de plantas están integradas por miembros con genomas de ARN de cadena simple de polaridad positiva. Una característica importante de los virus de ARN en general es su alta capacidad para cambiar en su secuencia genómica y así poder adaptarse a condiciones ambientales cambiantes. Estas variantes se crean mediante mutación, recombinación, duplicación y reordenamiento génico. La diversidad genética de un virus se deriva de interacciones complejas que involucran la aptitud de las variantes seleccionadas, la interacción con el vector, el rango de huéspedes, la interacción con otras especies virales, etc. Estas interacciones pueden tener consecuencias epidemiológicas graves, como cambios en la virulencia, la aparición de aislados capaces de superar la resistencia genética de las plantas o el aumento del rango de huéspedes.

    Con más de 15,000 hectáreas de invernaderos cada uno, el tomate y el pimiento son los cultivos protegidos más importantes en España. Los tomates silvestres (Solanum sección Lycopersicon, familia Solanaceae) son nativos del oeste de América del Sur (Ecuador, Perú y Chile), aunque su domesticación comenzó principalmente en México, Colombia y Bolivia, que se consideran como centros secundarios de diversificación. Solanum lycopersicum, el tomate cultivado, es una planta perenne que se comporta como anual cuando se cultiva. El tomate es uno de los frutos más versátiles en la cocina, siendo un elemento esencial en la cocina mediterránea que se utiliza crudo o cocinado y es la base de salsas como el kétchup. El tomate es el sexto cultivo en importancia económica en el mundo; en 2021, se estimó que se produjeron 189,133,955 toneladas en una superficie de 5,167,388 hectáreas, con un valor bruto de producción de más de 100 mil millones de dólares. España es el octavo productor de tomate en el mundo y el segundo en Europa después de Italia, con más de cuatro millones de toneladas producidas en 2021. La producción de tomate en España se encuentra principalmente en las provincias de Badajoz, Sevilla y Cáceres en campo abierto y Almería, Granada y Murcia en cultivo protegido. Un porcentaje importante de los tomates frescos producidos en España se destina a la exportación a Europa. Aunque los principales virus en los cultivos protegidos solían considerarse transmitidos mecánicamente, muchos virus emergentes en las últimas décadas en este tipo de agrosistemas son transmitidos por insectos, principalmente pulgones (Hemiptera: Aphididae), moscas blancas (Hemiptera: Aleyrodidae) y trips (Thysanoptera: Thripidae). Además de disminuir la producción directamente a través de la alimentación, se ha descrito que los insectos son vectores de más de 130 virus en los cultivos de tomate, causando enfermedades y grandes pérdidas económicas. En España, se han detectado virus transmitidos por insectos pertenecientes a varios géneros en los cultivos comerciales de tomate, incluyendo virus transmitidos por pulgones (cucumber mosaic virus y potato virus Y), virus transmitidos por moscas blancas (tomato chlorosis virus, tomato infectious chlorosis virus, tomato yellow leaf curl virus y virus relacionados, tomato torrado virus y tomato leaf curl New Delhi virus) y virus transmitidos por trips (tomato spotted wilt virus). Además, se encuentran presentes varios virus transmitidos por contacto, como Parietaria mottle virus, pepino mosaic virus, tomato mosaic virus y tomato brown rugose fruit virus.

    El pimiento (Capsicum annuum) es una planta perenne perteneciente a la familia Solanaceae que generalmente se cultiva como planta anual. Las especies silvestres del género Capsicum son nativas de Ecuador, Perú y Bolivia, y han sido domesticadas en América Central y del Sur. El pimiento y algunas otras especies de Capsicum son un elemento fundamental en la cocina mexicana y mediterránea, en parte debido a sus características picantes. En 2021, se produjeron 41,125,953 toneladas en 3,675,234 hectáreas en todo el mundo. España es el séptimo productor mundial y el primero en Europa, con 1,511,560 toneladas producidas en 22,240 ha en 2021. Las principales provincias productoras en España son Almería, Murcia y Granada, siendo Almería responsable de la mitad de la producción del país, principalmente en invernadero. Las enfermedades virales son probablemente el principal factor limitante para el cultivo de pimiento. Se han identificado más de 70 virus que infectan el pimiento y al menos 20 de ellos, pertenecientes a 15 familias, causan daños graves en los cultivos. En España se han detectado miembros de varios géneros transmitidos por insectos, que incluyen los transmitidos por pulgones (potato virus Y, Amaranthus leaf mottle virus, alfalfa mosaic virus, cucumber mosaic virus, broad bean wilt virus 1 y pepper vein yellows virus), los transmitidos por moscas blancas (tomato yellow leaf curl virus y virus relacionados, tomato chlorosis virus y tomato torrado virus) y los transmitidos por trips (tomato spotted wilt virus). Además, se han identificado varios virus transmitidos por contacto que infectan al pimiento en España: tobacco mosaic virus, pepper mild mottle virus y Parietaria mottle virus. Se han descrito brotes de una enfermedad transmitida por pulgones que afecta a los cultivos de pimientos en varios países desde la década de 1980. La enfermedad fue detectada por primera vez en la Prefectura de Okinawa, Japón, en 1981 y los síntomas característicos incluían amarilleo de las venas y enrollamiento de las hojas en plantas cultivadas en invernadero. El agente causal fue identificado como pepper vein yellows virus (PeVYV), un nuevo polerovirus (género Polerovirus, anteriormente incluido en la familia Luteoviridae pero actualmente clasificado en la familia Solemoviridae) transmitido por los pulgones Aphis gossypii y Myzus persicae de manera persistente y no transmitido mecánicamente ni por semillas. Una enfermedad similar fue descrita en el Valle de Arava, Israel, en 1998. Los síntomas descritos en este caso incluían acortamiento de los entrenudos del tallo, amarilleo interveinal y enrollamiento de las hojas y decoloración y reducción del tamaño de los frutos. El agente causal de esta enfermedad, también transmitido por A. gossypii y M. persicae y no transmitido mecánicamente, se denominó pepper yellow leaf curl virus (PYLCV). Síntomas similares a los observados en Japón e Israel también se han observado en cultivos de pimiento en muchos otros países del mundo asociados a la presencia de polerovirus, incluyendo Turquía, Túnez, España, India, Indonesia, Malí, Filipinas, Taiwán, Tailandia, Sudán, Estados Unidos, Costa de Marfil, China, Italia y Australia. Desde noviembre de 2012, se han observado brotes graves de una enfermedad novedosa para los agricultores en cultivos comerciales de pimiento en invernaderos en Almería, en el sureste de España. La prevalencia fue muy alta, alcanzando el 100% en muchos invernaderos. Los síntomas incluían amarilleo interveinal, enrollamiento de las hojas hacia arriba, acortamiento de los entrenudos y maduración anormal de los frutos, lo que reducía su comercialización. Estos síntomas recordaban a los causados por los polerovirus PeVYV en Japón y PYLCV en Israel. La secuenciación de un fragmento de ADN de 1,1 kb obtenido con una pareja de cebadores universales de polerovirus confirmó la infección por polerovirus en muestras de pimiento de Almería. La identidad de nucleótidos de los fragmentos de ADN amplificados mostró la mayor identidad (98,5% a 98,7%) con un aislado de PeVYV de Turquía.

    El género Polerovirus en la familia Solemoviridae (Riboviria, Orthornavirae, Pisuviricota, Pisoniviricetes, Sobelivirales) contiene virus icosaédricos con genomas monopartitos de ARN de cadena sencilla. Anteriormente, el género Polerovirus estaba incluido en la actualmente abolida familia Luteoviridae. Los miembros de la familia Solemoviridae se transmiten por pulgones de manera circulativa persistente. Los viriones no envueltos son icosaédricos, con un diámetro de 25 a 30 mm y sus genomas consisten en una sola molécula de ssRNA de sentido positivo lineal que varía de 4 a 6 kb. El ARN genómico tiene una pequeña proteína viral (protein genome-linked, VPg) unida covalentemente al extremo 5' y carece de una cola poli(A) en el extremo 3'. Los genomas de polerovirus, ejemplificados por potato leafroll virus, la especie tipo del género, contienen diez marcos de lectura abiertos (ORF0 a ORF8 y ORF3a). El ORF0 codifica un supresor de silenciamiento génico implicado en la sintomatología y el rango de huéspedes. Los ORF1 y ORF2 codifican proteínas relacionadas con la replicación, P1 y P2. P1 es una poliproteína que incluye un dominio transmembrana, la VPg y una proteasa de serina. P2 se expresa mediante un mecanismo de desplazamiento ribosomal a partir del ORF1 y codifica una ARN polimerasa dependiente de ARN. El ORF3 codifica la proteína de la cápsida y el ORF5 contiguo codifica un factor de transmisión por pulgones. El ORF3a codifica una proteína implicada en la infección sistémica. El ORF4, que se superpone con el ORF3, codifica una proteína de movimiento necesaria para el movimiento de célula a célula. Los ORF6 y ORF7 codifican proteínas que regulan la transcripción y la replicación del virus y el ORF8 codifica una proteína asociada a la replicación.

    En la década de 1980 se observaron síntomas de amarilleo nuevos para los agricultores en plantas de tomate cultivadas en California. Inicialmente, los síntomas se atribuyeron a trastornos fisiológicos o nutricionales e incluso a toxicidad por pesticidas, aunque la presencia de moscas blancas asociadas a plantas sintomáticas sugería una enfermedad viral. El agente causal se denominó tomato infectious chlorosis virus (TICV), demostrándose que era un miembro del género Crinivirus, perteneciente a la familia Closteroviridae, transmitido por la mosca blanca Trialeurodes vaporariorum. En 1981, se informó de una "enfermedad de hoja amarilla" en plantas de tomate cultivadas en Florida, con síntomas similares a los causados por TICV. Sin embargo, el virus que causaba esta enfermedad no presentaba reacción cruzada en hibridaciones con sondas específicas de TICV. Por otra parte, este virus se transmitía además mediante Bemisia tabaci, lo que sugería que se trataba de un segundo crinivirus que infectaba el tomate. Tras su caracterización biológica y genómica parcial, este virus se denominó tomato chlorosis virus (ToCV). Los síntomas foliares causados por ToCV también pueden confundirse con trastornos fisiológicos o nutricionales. Sin embargo, la evolución de la enfermedad presenta características específicas. Así, la clorosis intervenales comienza en las hojas más viejas, avanzando hacia la parte superior de la planta. En la etapa inicial de la infección, las áreas cloróticas suelen tener forma poligonal, limitada por las venas principales. En etapas avanzadas, pueden desarrollarse áreas amarillas intervenales con manchas necróticas de color marrón rojizo. Las hojas inferiores aparecen enrolladas, engrosadas y quebradizas al tacto. La pérdida de área fotosintética podría ser la responsable de la reducción del vigor observado en las plantas infectadas. La infección por ToCV reduce el crecimiento del fruto de tomate y retrasa su maduración, disminuyendo la cantidad de frutos comercializables. Como se mencionó anteriormente, ToCV se transmite mediante miembros de dos géneros de moscas blancas, Trialeurodes y Bemisia: T. vaporariorum, T. abutilonea y varias especies del complejo B. tabaci (New World-1, Middle East Asia Minor 1 y Mediterranean). En España, síntomas similares a los asociados con TICV/ToCV en Estados Unidos se detectaron inicialmente en cultivos de tomate en las provincias de Almería y Málaga en 1997. Pronto se confirmó que el virus causal era ToCV, siendo la primera identificación del virus fuera de los Estados Unidos. ToCV se encuentra actualmente ampliamente distribuido en España, incluyendo las provincias de Sevilla, Málaga, Granada, Almería, Murcia y Alicante, así como las Islas Baleares y las Islas Canarias. Desde que ToCV fue identificado por primera vez en Estados Unidos y luego en España, el virus ha ampliado enormemente su distribución geográfica, incluyendo actualmente más de 40 países y territorios en las Américas, Europa, África y Asia. Aunque ToCV se identificó por primera vez en tomates, infecta de forma natural más de 120 especies de plantas pertenecientes a 32 familias, incluyendo 30 especies de la familia Solanaceae. Las solanáceas huéspedes de ToCV incluyen cultivos tan importantes como el pimiento, la patata y la berenjena. El género Crinivirus en la familia Closteroviridae (Riboviria, Orthornavirae, Kitrinoviricota, Alsuviricetes, Martellivirales) contiene virus largos y flexuosos con genomas bipartitos de ARN de cadena sencilla (con la excepción de una especie con genoma tripartito). La familia Closteroviridae también contiene los géneros Ampelovirus, Bluvavirus, Closterovirus, Menthavirus, Olivavirus y Velarivirus. Las características generales de los miembros de la familia incluyen la restricción al floema y a las células acompañantes, así como genomas de ARN de cadena sencilla de polaridad positiva de gran tamaño, carecen de una cola de poli (A), siendo los genomas de ARN más grandes entre los virus de las plantas (de 15.5 a 19.5 kb). Este tamaño se traduce en una gran complejidad génica, originada por la adquisición de genes eucarióticos (por ejemplo, el homólogo de la proteína de choque térmico 70) y la duplicación de genes (por ejemplo, la duplicación del gen de la proteína de la cápsida que da lugar a una proteína principal de la cápsida (CP) y una proteína menor de la cápsida (CPm). Estos virus se transmiten de manera semipersistente por insectos pertenecientes al orden Hemiptera. Los miembros de cada género en la familia Closteroviridae se transmiten mediante insectos vectores específicos: ampelovirus y velavivirus por cochinillas (Pseudococcidae), crinivirus por moscas blancas (Aleyrodidae) y closterovirus por pulgones (Aphididae). Sus viriones (de 650 a 2200 de longitud y 12 nm de diámetro) poseen una morfología helicoidal similar a la de muchos otros virus filamentosos de plantas, pero son únicos al tener una morfología asimétrica, con un "cuerpo" constituido por la CP y una "cola" principalmente por la CPm, de ahí el nombre de "serpiente de cascabel" dado a esta peculiar estructura. Las moléculas de ARN de los crinivirus se encapsidan en viriones separados. ToCV posee un genoma bipartito con la organización típica de los miembros del género Crinivirus. El ARN1 contiene cuatro ORFs flanqueados por dos regiones no traducidas (UTRs) ubicadas en los extremos 5' y 3' de la molécula. El ORF1a se traduce en una poliproteína que contiene las regiones conservadas de proteasa, metiltransferasa y helicasa presentes en todos los miembros de la familia. El ORF1b codifica la ARN polimerasa dependiente de ARN, que se traduce mediante un desplazamiento de lectura +1 del ribosoma. El ORF2 codifica una proteína de 22 kDa que se ha descrito como un potente supresor de silenciamiento génico. El ORF3 codifica una proteína putativa de 6 kDa con un dominio transmembrana predicho, similar a otras proteínas ubicadas en el extremo 3' de otros crinivirus, con función desconocida. El ARN2 de ToCV codifica nueve ORFs también flanqueados por UTRs ubicadas en ambos extremos de la molécula. El ARN2 incluye el bloque de cinco genes característico de la familia Closteroviridae, que estarían involucrados en la encapsidación del genoma, el movimiento viral en la planta y la interacción con el insecto vector. Este bloque de genes está constituido por el ORF4 que codifica la proteína p4, rica en residuos hidrofóbicos; el ORF5 que codifica la proteína Hsp70h (relacionada con la familia de proteínas Hsp70 de eucariotas); el ORF7 que codifica la proteína p59; y el ORF9 y el ORF10 que codifican las proteínas CP y CPm, respectivamente. Se ha sugerido que la proteína CPm, por analogía con lo descrito para lettuce infectious yellows virus, estaría involucrada en la transmisión por el insecto vector. Ambas proteínas de la cápsida, CP y CPm, se han identificado como supresores de silenciamiento génico. El ORF6 codificaría una proteína putativa p8 con tamaño, posición genómica y secuencia similares a las proteínas de otros crinivirus. El ORF8 codificaría una putativa proteína p9, que se encuentra solo en miembros del género Crinivirus y cuya función es desconocida. El ORF11 codifica la proteína p27, que parece ser exclusiva de los crinivirus. Por último, el ORF12 codificaría una putativa proteína p7 con un dominio transmembrana que no muestra similitud significativa con ninguna proteína codificada por los genomas de otros crinivirus, por lo que parece ser exclusiva de ToCV.

    Los clones infectivos son poderosas y versátiles herramientas para por ejemplo identificar sin ambigüedad el virus asociado a una enfermedad, confirmando así los postulados de Koch. Nos permiten obtener poblaciones virales puras evitando infecciones mixtas, incluso en casos de virus presentes en bajas concentraciones en la planta huésped como ocurre en el caso de los closterovirus. La disponibilidad de dichos clones también es extremadamente útil para determinar el rango de huéspedes de un virus, reproduciendo la enfermedad que causa, así como para identificar fuentes de resistencia genética. Además, los clones infectivos son indispensables para realizar estudios funcionales mediante genética inversa, introduciendo diferentes tipos de mutaciones para obtener información sobre la funcionalidad de las proteínas virales y la biología del virus. Para obtener clones infectivos de virus de plantas de ARN de cadena sencilla de polaridad positiva, se sintetiza el ADNc de longitud completa del genoma viral mediante transcripción inversa, se amplifica por PCR y se clona en un vector adecuado. A veces, los genomas largos se ensamblan mediante la unión de fragmentos superpuestos que comparten sitios de restricción. Para iniciar la transcripción in vitro a partir de los clones de longitud completa, se fusiona un promotor de la ARN polimerasa de un fago al extremo 5' del ADNc y se incorpora un sitio de restricción único en el extremo 3' para finalizar la transcripción mediante digestión. En muchos casos, la incorporación de un análogo de caperuza (cap) en el extremo 5' de los transcritos in vitro aumenta la infectividad. Los transcritos obtenidos in vitro se pueden inocular mecánicamente en las plantas huésped. En los casos en que se prefiere la transcripción in vivo, el promotor constitutivo 35S de cauliflower mosaic virus es un candidato excelente para iniciar la transcripción, utilizando el terminador de la sintasa de nopalina (nos) de Agrobacterium tumefaciens para finalizar la transcripción. En estos casos, las construcciones suelen clonarse en un vector binario para mediar la infección utilizando A. tumefaciens transformado (agroinoculación). Los clones infectivos deben diseñarse de manera que el primer nucleótido viral se posicione en el primer nucleótido transcrito tras el promotor, evitando también nucleótidos adicionales en el extremo 3'. Se ha demostrado que los nucleótidos no virales adicionales en ambos extremos de los transcritos tienen efectos adversos en la infectividad. En este sentido, cabe mencionar que se han identificado dos señales de poliadenilación que crean diferentes sitios de terminación/poliadenilación en el terminador nos. De hecho, el mapeo del sitio de poliadenilación en los transcritos controlados por el terminador nos muestra un patrón difuso, con la escisión ocurriendo en varias ubicaciones diferentes después de la señal de poliadenilación. También debe tenerse en cuenta muchos virus de ARN, como por ejemplo los miembros de las familias Closteroviridae y Solemoviridae no poseen colas poli(A) en sus genomas. Una alternativa para solucionar estas dificultades es incorporar la secuencia del ribozima de hepatitis delta virus (HDV-Rb) en el extremo 3' del genoma viral, coincidiendo así el sitio de autoescisión con el último nucleótido viral. La secuencia HDV-Rb se puede incluir en un vector de clonación para facilitar la construcción de clones infectivos. Un ejemplo de tales vectores de clonación es el vector pJL89, que se ha utilizado con éxito para acomodar grandes insertos de ADNc para su transcripción sin nucleótidos virales adicionales. El gran tamaño de algunos ARN virales, como en el caso de la familia Closteroviridae de virus de plantas y la familia Coronaviridae de virus de animales, presenta varios obstáculos al construir un ADNc infectivo o un transcrito in vitro: i) las secuencias de ARN largas dificultan la síntesis de una molécula de ADNc precisa, ya que la fidelidad de la transcripción reversa y PCR (RT-PCR) para la amplificación de ADNc disminuye proporcionalmente a la longitud del ARN, ii) las secuencias de ARN largas tienen más probabilidades de codificar proteínas tóxicas, lo que hace que la secuencia de ADNc sea inestable en los plásmidos, y iii) es difícil encontrar un vector adecuado que pueda acomodar grandes insertos de ADNc. Aun así, estas dificultades se han superado en gran medida y se han construido clones infectivos incluso para citrus tristeza virus que posee el mayor genoma de ARN entre los virus de plantas (aproximadamente 20 kb) y para coronavirus. Una vez construidos, los clones infectivos de closterovirus son difíciles de mantener debido a la existencia de secuencias virales que supuestamente codifican productos con toxicidad para Escherichia coli. La inestabilidad causada por la toxicidad se ha superado en los closterovirus y otros virus de ARN de cadena simple mediante el uso de cepas especiales de E. coli cultivadas a bajas temperaturas, la inserción de intrones de plantas para interrumpir la expresión de secuencias tóxicas, la introducción de mutaciones de cambio del marco de lectura y mediante el uso de vectores con bajo número de copias. Los clones infectivos diseñados para producir transcritos virales in vitro presentan una serie de limitaciones: los transcritos largos y frágiles son difíciles de manipular e inocular y la presencia de mutaciones, nucleótidos no virales, ausencia de estructura cap y la necesidad de secuencias precisas en los extremos 5' y 3' pueden comprometer la infectividad. Además, generalmente es necesario inocular los transcritos en protoplastos de plantas modelo como N. benthamiana o N. tabacum para generar una progenie viral. En los casos en los que se obtienen viriones en protoplastos, se necesitan pasajes sucesivos para obtener una cantidad suficiente de virus para inocular plantas completas. Para evitar las dificultades asociadas con la producción e inoculación de transcritos virales obtenidos in vitro, la transcripción in vivo de clones infectivos de ADNc es una buena alternativa. Estos clones se pueden inocular en plantas mediante bombardeo biolístico o por agroinoculación. En ambos casos, el ADNc viral suele posicionarse entre el promotor constitutivo 35S y el terminador nos, con o sin secuencia HDV-Rb. Después de grandes esfuerzos, se han desarrollado clones infectivos para la transcripción in vitro de seis miembros de la familia Closteroviridae: beet yellows virus, citrus tristeza virus, lettuce infectious yellows virus, lettuce chlorosis virus, tomato chlorosis virus y cucurbit yellow stunting disorder virus. Por otro lado, se han desarrollado clones agroinfectivos para los siguientes miembros de esta familia: BYV, grapevine leafroll-associated closterovirus 2 (GLRaV-2), CTV, LIYV, LCV y ToCV. Los clones agroinfectivos de los miembros de la familia Closteroviridae no pueden, en general, infectar directamente a sus huéspedes naturales. Varias razones pueden explicar este fenómeno, incluida la degradación del ARN desencadenada por las formas replicativas de doble cadena debido a la maquinaria de silenciamiento génico de la planta y la indisponibilidad de cepas de A. tumefaciens capaces de infectar huéspedes específicos. Incluso en los casos en que se ha demostrado que los transcritos in vitro son infectivos en protoplastos del huésped natural (por ejemplo, CTV en cítricos, CYSDV en pepino y ToCV en tomate), no se ha logrado la infección de plantas completas. Aunque la replicación de GLRaV-2 tiene lugar en plantas jóvenes de vid micropropagadas tras su agroinoculación con un clon infectivo, estos resultados no se pudieron reproducir en plantas maduras. Se han desarrollado varias estrategias para superar las barreras para la infección de plantas de los huéspedes naturales. Así, los viriones de LIYV y LCV purificados de plantas de N. benthamiana se han transmitido a plantas de lechuga mediante mosca blanca y un sistema de alimentación artificial a través de membrana. Además, se ha logrado la infección de plantas de cítricos con CTV mediante la inoculación mecánica con viriones parcialmente purificados de hojas de plantas de Nicotiana benthamiana agroinfectadas. Asimismo, se infectaron plantas de tomate con ToCV mediante el injerto de tallos de plantas de N. benthamiana agroinfectadas. La manipulación de clones infectivos de miembros de la familia Closteroviridae ha permitido incrementar nuestro conocimiento sobre el papel de las proteínas virales en la replicación, encapsidación, movimiento a través de la planta y supresión del silenciamiento génico. Además, los mutantes virales generados a partir de clones infectivos de lettuce infectious yellows virus se han utilizado para analizar la transmisión del virus por el insecto vector insecto.

    En la investigación en el ámbito de la virología vegetal se siguen varios pasos clave para la caracterización y control de los virus de plantas. En primer lugar, la identificación y caracterización viral implican el aislamiento y secuenciación del genoma viral para determinar su taxonomía. En segundo lugar, es crucial comprender los mecanismos de transmisión de los virus de plantas, incluyendo la identificación de los vectores responsables de propagar los virus en la naturaleza. Además, dilucidar las interacciones entre el virus y la planta huésped a nivel molecular ayuda a comprender el proceso de infección y los mecanismos de defensa de la planta. Además, estudiar la epidemiología y ecología de los virus de plantas ayuda a determinar sus patrones de propagación y los factores ambientales que influyen en su prevalencia. Por último, desarrollar estrategias efectivas de control, como la selección de cultivares resistentes o la implementación de prácticas culturales, es esencial para mitigar el impacto de las enfermedades virales en la producción de los cultivos. Estas áreas contribuyen en conjunto a avanzar en nuestro conocimiento de los virus de plantas y a diseñar estrategias para su manejo y control. Varios de estos pasos clave se han considerado en este trabajo, utilizando como modelos virus emergentes que afectan los cultivos de solanáceas en España, tomate y pimiento, definiendo los principales objetivos de los tres capítulos: i. Caracterizar genéticamente un aislado español de polerovirus que infecta los cultivos protegidos de pimiento, incluyendo la secuenciación completa del genoma y resolviendo su posición taxonómica.

    ii. Generar clones infectivos de tomate chlorosis virus (ToCV) con una mayor eficiencia de agroinoculación mediante la incorporación de la secuencia del ribozima de hepatitis delta virus.

    iii. Desarrollar un conjunto de clones agroinfectivos del RNA2 de ToCV con deleciones parciales que afectan el gen de la proteína menor de la cápsida (CPm), con el objetivo de determinar los determinantes específicos de transmisión por especies de mosca blanca.

    Capitulo 1 En este estudio, secuenciamos un aislado de polerovirus de España que infecta pimiento y demostramos su transmisión por el pulgón Aphis gossypii. Se llevó a cabo la comparación del genoma del aislado español con aislados de polerovirus que infectan pimiento de Japón, Israel, China y Australia. El aislado español exhibió la organización típica de los polerovirus, compuesta por siete marcos de lectura abiertos (ORF0 a ORF5 y ORF3a), que posiblemente codifican las proteínas P0 a P5 y P3a. Al comparar la secuencia española con las cuatro secuencias completas disponibles de polerovirus que infectan pimiento, encontramos una relación más cercana con el aislado israelí, sugiriéndose también la existencia de un complejo con al menos cinco especies de polerovirus. Considerando la similitud de los síntomas causados por todos los polerovirus descritos que infectan de forma natural al pimiento, proponemos denominarlos "pepper vein yellows virus 1" a "pepper vein yellow virus 5¿ (PeVYV-1 a PeVYV-5), siendo PeVYV-5 el correspondiente al polerovirus de España descrito en este estudio. Nuestros resultados, junto con hallazgos previamente publicados, resaltan la alta complejidad de los polerovirus emergentes que amenazan los cultivos de pimientos en todo el mundo, destacando los eventos de recombinación que están en el origen de dicha complejidad y diversidad.

    Capítulo 2 La disponibilidad de clones infectivos de virus de plantas es un recurso indispensable y de gran valor para llevar a cabo estudios de genética reversa. En el caso de los miembros de la familia Closteroviridae, dado el tamaño y la complejidad de sus genomas, la construcción de dichos clones ha sido dificultosa. En este trabajo hemos intentado incrementar la infectividad de los clones existentes de ADNc agroinfectivos de ToCV (aislado AT80/99-IC de España) mediante la incorporación del ribozima de hepatitis delta virus (HDV) fusionado a los extremos 3' de los componentes genómicos RNA1 y RNA2. La inclusión del ribozima resultó en una progenie viral con extremos 3' del RNA1 más similares a los del clon utilizado para la agroinoculación. Sin embargo, al igual que los clones originales, los clones modificados no pudieron infectar directamente plantas de tomate mediante agroinoculación. No obstante, la infectividad en N. benthamiana de los clones que incluían el ribozima de HDV aumentó al doble, en promedio, en comparación con los clones disponibles anteriormente.

    Capítulo 3 Los componentes genómicos de ToCV, ARN1 y ARN2, se encapsidan individualmente en partículas flexuosas con una estructura distintiva caracterizada por un "cuerpo" largo y una "cola" corta, de ahí el nombre de ¿serpiente de cascabel¿ dado a esta peculiar estructura. El cuerpo del virión consiste en la proteína CP, mientras que la cola contiene la proteína CPm. El gen que codifica la CPm se originó a partir de la duplicación y divergencia del gen de la CP. Se cree que la CPm de los crinivirus es crucial para la transmisión por moscas blancas que actúan de vectores naturales. Basándonos en la información disponible, formulamos la hipótesis de que el o los determinantes de la transmisión dual de los crinivirus por miembros de los géneros de mosca blanca Bemisia y Trialeurodes se encuentran localizados en la CPm. Para investigar este aspecto de la biología de los crinivirus, realizamos en primer lugar un análisis in sílico comparando la CPm de las especies caracterizadas hasta la fecha, con el objetivo de identificar las posibles regiones responsables de la transmisión de ToCV por B. tabaci y T. vaporariorum. Nuestro análisis reveló una región central de la CPm exclusiva de los crinivirus transmitidos por T. vaporariorum. Posteriormente, utilizando un sistema de clones agroinfectivos de ToCV, generamos un conjunto de mutantes de deleción dirigidos a la región central de la CPm y sus subregiones. Cuatro de los cinco mutantes de deleción fueron infectivos cuando se agroinocularon en plantas de N. benthamiana. La disponibilidad de estos clones infectivos de ARN2 de ToCV sientan las bases para futuras investigaciones que podrán dilucidar el papel de regiones específicas de la CPm en la transmisión de este virus por diferentes especies de mosca blanca.